マウスモデルにおける生弱毒スポロゾイトによる皮内免疫

要約

出典:Mac-Daniel, L., et al. 生弱毒マラリア原虫スポロゾイトによる皮内免疫後のマウス皮膚からの骨髄細胞の単離とリンパ節の排出。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、弱毒化した生きたスポロゾイトでマウスモデルを免疫するためのアッセイを示しています。放射線が弱毒化されたマラリア原虫スポロゾイトは、マウスの耳の背側に注入されます。両耳の複数の場所に注射した後、マウスは回復します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 材料と試薬

1. 雌のAnopheles stephensi蚊(Sda500株)を使用して、感染したマウスを出現後3〜5日で餌とし、前述のように育てます。
2. 構成的熱ショックタンパク質70(HSP70)プロモーターの制御下で、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を発現する寄生虫Plasmodium berghei ANKAクローンを使用します。これにより、寄生虫のライフサイクル全体を通じて明るい蛍光が得られます。
3. 雌のC57BL/6JRjマウス(7週齢)を使用.
   手記：記載されているプロトコルで使用されるすべての試薬は、材料/機器のT.ableに記載されています。

2. 蚊の唾液腺からの放射線減衰スポロゾイトの分離

1. 感染性の血液食の18〜25日後、前述のように、蚊を氷上の15mlのチューブに集めて冷気麻酔をかけます。チューブを反転させて、それらをペトリ皿に慎重に移します。昆虫を氷の上に置き、蚊を12クラッドのγまたはX線量にさらします。
2. 前述のように、照射された蚊の唾液腺から弱毒化されたスポロゾイトを分離します。感染した唾液腺を少量 (約15 μl) の 1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) に氷上で採取し、それらを穏やかに粉砕してスポロゾイトを放出します
   手記： したがって、高濃度の寄生虫懸濁液を少量で注入することは重要であるため、緑色蛍光の強力な発現によって証明されるように、事前に選択された感染性の高い多数の蚊から十分な数の唾液腺を採取することが不可欠です。
3. 凝集物や蚊の破片を除去するために、低接着性の1.5 ml微量遠心チューブに適合した35 μmセルストレーナーキャップでスポロゾイト懸濁液をろ過します。
4. 前述のように単離されたスポロゾイトの総数を数え、冷たい1x DPBSで寄生虫懸濁液の濃度を調整して、83,000スポロゾイト/μlを得ます。次のステップを続けながら、寄生虫を氷上に保存します。
5. ネガティブコントロールとして使用する感染していない蚊から同数の唾液腺を採取し、ステップ2.2および2.3で説明されているようにサンプルを処理します。上記のようにサンプルを希釈して、懸濁液中の唾液腺抽出物と同濃度になるようにします
   手記： スポロゾイトは、最大2時間氷上に保存できます。ただし、唾液腺を粉砕してから1時間以内に注射するのが理想的です。

3. 耳の真皮層へのスポロゾイトの注入

1. ケタミン(50 mg / kg)/ キシラジン(5 mg / kg)混合物の腹腔内注射により動物に麻酔をかけます。.マウスが意識不明の状態になるまで5〜8分待ち、角膜の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗布します。麻酔の深さを評価するには、両後足でつま先を優しくつまむようにします。
   手記： 麻酔の投与は20分未満続くため、次のステップは迅速に行う必要があります。
2. マウスの耳介を安定させるには、腹側を事前に実体顕微鏡の下に置いた透明なテープで固定します(図1A)。血管系の損傷を避けるために、耳をそっと押します。
3. 10 μLシリンジ/35ゲージの面取り針に0.6 μlの再懸濁寄生虫をロードします。
4. スポロゾイト懸濁液を4つの注入部位(1部位あたり0.15 μl)に送達するには、耳の背側(図1A)の表皮の下に針を慎重に挿入し、血管が入らないように注意しながら面取りをします。注射剤の逆流を防ぐために、針を真皮に数秒間置いてから取り外してください。手順の最後に、各注射部位で特徴的な丘疹を観察します(図1Bおよび1C)。
5. 注射後、テープから耳を慎重に取り外します。
6. 手順3.2〜3.4に従って、同用量の寄生虫を反対側の耳に注射します。
7. 2匹のマウスに追加で1x DPBS0.6μlまたは0.6μlの1x DPBS+唾液腺抽出物を非感染蚊から注入して、注射のみによる炎症反応と真皮への蚊の物質の沈着を評価します。
8. マウスをケージに戻す前に、麻酔からのマウスの回復を監視します。
   手記：皮膚における適切なスポロゾイト沈着は、前述のようにマウスを調製する蛍光顕微鏡(図2Aおよび図2B)によってモニターすることができる。

結果

図 1: 私はマウスの耳にスポロゾイトを注入します。(A)麻酔をかけたマウスの耳介へのスポロゾイトの皮内注射を示す画像。耳の腹側は、以前に解剖顕微鏡の下に置かれた透明なテープで安定しています。針は、面取りを上にして、耳の背側、表皮の下に慎重に挿入されます。(B-C)0.1-0.2μlの寄生虫懸濁液の皮内注射前(B)と(C)後の耳介の背側を示す写真。手術終了時の注射部位に特徴的な丘疹(黒矢印)が観察できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン:イマルジーン® 1000	メリアル	-	-
キシラジン:ロンプン® 2%	バイエル	-	-
NanoFilシリンジ+35ゲージ針	世界の精密機器	-	-
オムニカン® 50 インスリン シリンジ 0.5 ml/50 I.U.	B.ブラウンメディカル	9151125	-
MultiwellTM 6ウェル組織培養プレート – フラットボトム	BDファルコン	353046	-
70 μmセルストレーナー	BDファルコン	352350	-
2mlシリンジ	テルモ	SS-02S	-
BLUE MAXTM 15ml ポリプロピレン製コニカルチューブ	BDファルコン	352097	-
BLUE MAXTM 50ml ポリプロピレン製コニカルチューブ	BDファルコン	352098	-
5mlポリスチレン丸底チューブ、35μmセルストレーナーキャップ付き	BDファルコン	352235	-
DPBS 1X Cacl2 および MgCl2 フリー	ライフテクノロジー	14190から094	-
DMEM 1X + GlutaMAXTM	ライフテクノロジー	31966-021	-
デオキシリボヌクレアーゼI.(ウシ膵臓由来、IV型)	シグマ・アルドリッチ	D5025	50μg/ミリリットル
雌C57BL/6JRjマウス(7週齢)	ジャンビエ研究所	-	-