人工多能性幹細胞からの単一陽性CD8 T細胞の生成

要約

出典:Good, M. L., et al.腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト人工多能性幹細胞を使用。J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオは、腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞(iPSC)由来のCD8αβ+ T細胞を生成するアッセイを示しています。腫瘍抗原特異的iPS細胞は、間質細胞単層上で増殖し、造血前駆細胞(HPC)に分化します。HPCは、分化培地を用いてCD4+ CD8+二重陽性T細胞に分化します。次に、これらの細胞を刺激して、CD8を発現する単一陽性T細胞を生成します。

プロトコル

1. マウス胚性線維芽細胞(MEF)上でのヒトiPSC(hiPSC)の培養

>注:ゼラチン、ゼラチン状タンパク質混合物、組換えラミニン511、またはhiPSCの増殖に使用される他の細胞外マトリックスでプレコートされた6ウェルプレートに播種し、ヒト多能性幹細胞培養用に特別に調製された既定培地を使用して培養するなど、hiPSCを培養するための代替方法も使用できます。

1. MEFの培養
   1. 10 cmの細胞培養シャーレに4 mLの0.1%ゼラチンをコーティングし、37°Cで30分間インキュベー
   トします。
   2. 4 x 10⁶ を照射した MEF のバイアルを 10 mL の 37 °C MEF 培地 (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% ウシ胎児血清 (FBS) + 1x ペニシリン-ストレプトマイシン + 1x L-グルタミンサプリメント) にすばやく解凍します。300 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを9 mLのMEF培地に再懸濁します。
   3. ゼラチンでコーティングされた皿をインキュベーターから取り出します。ゼラチンを吸引し、7 mLのMEF培地を追加します。3 mLのMEF懸濁液(ステップ1.1.2から)をゼラチンコーティングされた皿にプレートします。皿を左右および前後に揺らして、MEFが皿全体に均一に分布するようにします。37°Cで8〜36時間インキュベートします。
2. MEF
   でのhiPSCの継代 注:データは、長期培養黒色腫腫瘍浸潤リンパ球(TIL)に由来するT細胞1(MART-1)iPS細胞によって認識されるメラノーマ抗原を使用して生成されました。これは、ヒト白血球抗原(HLA)-A * 02:01のコンテキストでMART-1ペプチドを特異的に認識します。
   1. コロニーの直径が0.8〜1.2mmの場合のiPSCの通過。継代する前に、実体顕微鏡でhiPSCコロニーをチェックし、200 μLチップのプラスチックエッジを使用して培養物から分化領域を取り除きます。
   2. 使用済み培地を吸引し、10 mL の hiPSC 培地(ヒト胚性幹細胞 [ES] 培養培地 [材料表] + 10 ng/mL ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 [hbFGF]) に 10 μM Rho 関連プロテインキナーゼ (ROCK) 阻害剤を添加します。
   3. 細胞培養ディッシュを片手で持ち、使い捨ての細胞継代ツールをディッシュ全体に一方向に転がします。ローラーブレード全体が培養皿に接触し、ローリング動作中に均一な圧力を維持するように十分な圧力を加えます。
   4. 培養皿を90°回転させ、手順1.2.3を繰り返します。顕微鏡でプレートを見て、コロニーの適切な切断を視覚的に確認します。200 μLピペットを使用した穏やかな機械的フラッシングにより、切断されたコロニーを分離します。
      手記：機械的なフラッシングによるカットコロニーの剥離は、ローラーでコロニーを切断した直後に行う必要があります。なぜなら、3分後にはカットされたコロニーがディッシュに再付着し始め、フラッシングによって均質なサイズのコロニーを剥離することが困難になるからです。
   5. 350 - 600 個の切断コロニーの塊を、10 mL の新鮮な hiPSC 培地に 10 μM ROCK 阻害剤を添加した新しい 10 cm の MEF ディッシュ (hiPSC 継代の 8 - 36 時間前にメッキ) に移します。37 °C.
      でインキュベートします。 注:600個の塊は約1.0 x 10⁶ MART-1 iPSCを表し、35日目には0.5-1.0 x 10⁶ DP細胞を産生します。ただし、予想される数値は、開始細胞株の効力と培養条件によって異なります。
   6. 翌日、使用済み培地を吸引し、10 mLの新鮮なhiPSC培地を加えます。hiPSCの増殖速度に応じて、1〜2日ごとにhiPSC培地を交換してください。

2. hiPS細胞との共培養に向けたOP9/DLL1細胞の作製

1. OP9/DLL1細胞をOP9培地[α-最小必須培地(α-MEM)+20%ウシ胎児血清（FBS)+1xペニシリン-ストレプトマイシン]で37°Cで培養します。OP9/DLL1細胞がコンフルエントに達したら、培地を吸引し、5 mLの1x マグネシウム、カルシウム、およびフェノールの赤色を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄します。
2. PBSを吸引し、0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を2mL加えます。.37°Cで5分間インキュベートします。次に、4 mLのOP9培地を添加し、ピペッティングで細胞層を機械的に解離させて単一細胞懸濁液を作製します。
3. 細胞懸濁液を100 μmの細胞ストレーナーを介して50 mLのコニカルチューブに移し、細胞凝集を防ぎます。300 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引し、12 mLのOP9培地に再懸濁します。
4. 8 mLのOP9培地を6つの新しい10 cm細胞培養シャーレに加えます。ステップ 2.3 の OP9/DLL1 細胞懸濁液 2 mL を新しい 10 cm ディッシュにそれぞれプレートします。ディッシュを左右に揺らし、次に前から後ろに揺らして、OP9 / DLL1がディッシュ全体に均等に分布するようにします。
5. 37°Cでインキュベートし、細胞がコンフルエンシーに達するまで2〜3日ごとに継代を繰り返します.
   手記：OP9/DLL1細胞の凍結ストックを十分に作成し、4〜6週間ごとに新しいストックを解凍することが重要です。

>3. ヒトiPS細胞のCD8αβ+シングルポジティブ(SP)T細胞へのin vitro分化

1. 糊化したOP9/DLL1皿は、hiPSCとの共培養の1週間前に調製します。0.1%ゼラチン溶液を調製するには、5 mLの室温(RT)組織グレードストックゼラチン溶液を500 mLのPBSに加えます。
   1. 0.1%ゼラチンの皿あたり4mLを加えて、新しい10cm細胞培養ペトリ皿3枚をコーティングします。37°Cで30分間インキュベートします。
   2. ゼラチンを吸引し、各皿に8mLのOP9培地を加えます。OP9/DLL1のコンフルエントディッシュ1(上記のセクション2で行ったように)を3つのゼラチンプレコートディッシュに通過させます。
2. 4日後、ゼラチン上のOP9 / DLL1の各10 cm皿に10 mLのOP9培地を加え、皿ごとに20 mLの培地
を加えます。.
3. 7〜8日後、OP9/DLL1コンフルエントディッシュでhiPSC共培養を開始します(分化0日目)。
   1. MEF上のhiPSCのコンフルエント10cmディッシュから使用済み培地を吸引します。OP9培地10mLを加えます。手順1.2.3および1.2.4で行ったように、使い捨ての細胞継代ツールを使用してhiPSCコロニーを切断および分離します。
   2. 200 μLピペットを使用して、350〜600個のカットコロニーの塊を10 cmのゼラチン化済みOP9/DLL1ディッシュ(ステップ3.1)に移し、10 mLの新鮮なOP9培地を入れます。培養皿を左右に、次に前から後ろに揺らして、コロニーが均等に分布するようにします。
      手記：あるいは、予め形成されたhiPSC胚様体(EB)または小さな凝集懸濁液を使用してもよい。しかしながら、均一なサイズのhiPSC塊を作製するためには、使い捨ての細胞継代ツールまたはEB形成システムを使用することが好ましい。
4. 1日目に、使用済み培地を吸引し、20 mLの新鮮なOP9培地と交換します。OP9/DLL1で1日間共培養したhiPSC凝集体は、小さな丸い単層コロニーとして現れます(図1)。
5. 5日目に、10 mLの使用済み培地を吸引し、10 mLの新鮮なOP9培地を追加します。hiPSCコロニーは、多層の暗い中心を特徴とする原始的な中胚葉に分化し始めます。
6. 9日目に、10 mLの使用済み培地を吸引し、10 mLの新鮮なOP9培地を加えます。このとき、多層的な中心構造がドーム状に進化し、周辺ネットワーク状の領域が明らかになります。
7. 13日目に造血前駆細胞(HPC)を採取します。13日目のhiPSC由来の構造は、ドーム状領域のネットワークに囲まれた暗い中央オルガノイドによって特徴付けられます。これは、以前にヒト胚性幹細胞由来造血前駆細胞を囲むと報告された造血ゾーン(HZ)を代表するものです。
   注:ドーム状の構造の存在は、暗い中心がなくても成功したプロセスを示しています。HPCを作製できないのは、OP9/DLL1の品質の低さ、FBSロットの品質、OP9/DLL1に播種されたiPS細胞の塊の合流性(350-600の塊が最適)、および/またはiPS細胞株の造血前駆体の効力の変動が原因である可能性があります。
   1. 使用済み培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムで修飾した1x フェノールレッドフリーのハンクス平衡塩溶液(HBSS)5 mLで1回洗浄します。
   2. HBSSを吸引し、10 mLのHBSSに250 μLの5000 Units/mLコラゲナーゼIVを加えます。37°Cで45分間インキュベートします。HBSSをコラゲナーゼIVで吸引し、5 mLのPBSで1回洗浄します。
   3. PBSを吸引し、0.25%トリプシン-EDTAを5mL加えます。.37°Cで20分間インキュベートします。次に、4 mLのOP9培地を添加し、ピペッティングで細胞層を解離して単一細胞懸濁液を調製します。
   4. 細胞懸濁液を100 μmの細胞ストレーナーを介して50 mLのコニカルチューブに移します。300 x g で 5 分間、4 °C で遠心分離し、上清を吸引し、10 mL の OP9 培地に再懸濁します。
   5. 新しいゼラチン化した10 cm細胞培養ペトリ皿に細胞懸濁液をプレート化します(ステップ3.1.1および3.1.2を参照)。37°Cで45分間インキュベートします。次に、穏やかなピペッティングにより非接着性細胞を回収します。
   6. 収集した細胞懸濁液を100 μmの細胞ストレーナーを介して50 mLのコニカルチューブに移します。300 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を吸引し、10 mLの分化培地[5 ng/mLヒト幹細胞因子(hSCF)、5 ng/mLヒトFlt3リガンド(hFLT3L)、および5 ng/mLヒトインターロイキン7(hIL-7)]を含むOP9培地]に再懸濁します。
   7. 細胞懸濁液を新しい10cmのOP9/DLL1コンフルエントディッシュにプレートします。
8. 16日目に、細胞を継代します。
   1. 非接着性細胞を穏やかなピペッティングで機械的に剥離し、100 μmの細胞ストレーナーでろ過します。300 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を吸引し、10 mLの分化培地に再懸濁します。
   2. 細胞懸濁液を新しい10cmのOP9/DLL1コンフルエントディッシュにプレートします。
その後、
9. ステップ3.8を繰り返して、5〜7日ごとに非接着細胞の継代を続けます。
10. 35日目に、CD4+CD8+ダブルポジティブ(DP)集団を濃縮し、CD8αβ+シングルポジティブ(SP)T細胞の産生を刺激します(図2)。
    1. 100 μmの細胞ストレーナーで静かにピペッティングおよびろ過し、凝集体を除去することにより、非接着性細胞を機械的に剥離します。製造元のプロトコルに従ってCD4磁気ビーズ単離することにより、CD4+細胞集団を濃縮します.
       手記： CD4磁気ビーズを使用する理論的根拠は、CD4-CD8-ダブルネガティブ(DN)細胞を培養物から除去することです。これは、CD4-CD8-ダブルネガティブ(DN)細胞が刺激後にCD4+CD8+ DP細胞を直接殺すことが実証されているためです。
    2. ノイバウアー血球計算盤とトリパンブルー色素を使用して、CD4が濃縮された生細胞をカウントします。OP9培地に0.5 x 10⁶細胞/mLの総濃度で懸濁します。1 mLの細胞懸濁液(0.5 x 10⁶細胞)を、コンフルエントOP9 / DLL1の組織培養平底24健康なプレートの各ウェルに分注します。
    3. 100 IUのヒトインターロイキン2(hIL-2)、5 ng/mLのhIL-7、500 ng/mLの抗ヒトCD3抗体、および2 μg/mLの抗ヒトCD28抗体を添加し、37°Cで培養します。

結果

図1:hiPSC由来の造血前駆細胞の作製。 (A)OP9/DLL1共培養を用いたhiPSCsの造血系統への分化の概略図。(B)1日目(左上)、3日目(右上)、7日目(左下)、13日目(右下)のhiPSC由来構造体の出現。スケールバー = 100 μm. (C) 13日目のhiPSC由来CD34+CD43+造血前駆細胞のフローサイトメトリー解析。データは6つの独立した実験(n = 1から2)を表しています。

図2:hi...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cm皿	コーニング株式会社	353003
抗CD3、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 561812, RRID:AB_1089628
抗CD34、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 348791, RRID:AB_400381
抗CD4、ヒト	バイオレジェンド	Cat# 344612, RRID:AB_2028479
抗CD43、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 560198, RRID:AB_1645460
抗CD7、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 555361, RRID:AB_395764
抗CD8a、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 555369, RRID:AB_398595
抗CD8b、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 641057, RRID:AB_1645747
抗TCRb、ヒト	BDバイオサイエンス	Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 ヒトモノクローナル抗体 (15E8)、純粋機能グレード	ミルテニルバイオテック	〒130-093-375
CD3ヒトモノクローナル抗体(OKT3)、純粋機能グレード	ミルテニルバイオテック	〒130-093-387
CD4マイクロビーズ、ヒト	ミルテニルバイオテック	〒130-045-101
セルストレーナー 100 um	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-549
ウシ胎児血清(FBS)	双子座	100〜500
Flt-3配位子	R&Dシステム	427-FL
ゼラチン溶液 2%	シグマ・オルドリッチ	G1393-100ミリリットル
GlutaMAX (100倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050-061	L-グルタミンサプリメント
HBSS MG + Ca+ フェノールレッドフリー	ギブコ	14025-092
インターロイキン-2	R&Dシステム	202-ILの
インターロイキン-7	R&Dシステム	407ミリリットル
iTAG MHC テトラマー HLA-A*0201 Mart1 テトラマー -ELAGIGILTV	MBLの	カタログ番号#TB-0009-2
Mart1-hiPSCの	Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 (英語	理研-分子研
メランA、マート1(26-35)	イノペップ	〒3146-0100
MEM非必須アミノ酸溶液	ギブコ	11140050
αMEMパウダー	ギブコ	61100061
マウス胚性線維芽細胞(MEF)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C57BL/6 MEF MITC処理 各4M;A34962の
OP9/N-DLL1	理化学研究所バイオリソースセンター	猫#RCB2927;RRID:CVCL_B220	OP9/DLL1
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140-122
リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (1x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10010-023
霊長類ES細胞培地	リプロセル	RCHEMD001	ヒトESC培養培地
Rhok阻害剤(Y-27632二塩酸塩)	トクリス	1254
RPMIの1640	ギブコ	11875093
幹細胞因子(SCF)	R&Dシステム	455-MC
ステムプロ	EZパートナー	23181-010
T2腫瘍	ATCCの	T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™)
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25300-062
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25200-072
Uボトム96ウェルプレート	コーニング株式会社	3799

の ) 名 の 名