の形態素解析ショウジョウバエ幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

サマリー

の樹状分枝感覚ニューロンショウジョウバエ幼虫の末梢神経系は、一般とニューロンの分化のニューロンクラス特有のメカニズムの両方を解明するために有用なモデルです。我々は樹状突起分枝の神経細胞遺伝学的モザイクを生成して解析するための実用的なガイドを提示する。

要約

神経系の発達には、正確なニューロンのクラス特有の樹状突起の発達と軸索の配線が続くニューロンの位置と同一の正確な仕様が必要です。最近ショウジョウバエの幼虫の末梢神経系（PNS）の樹状分枝（DA）の感覚ニューロンは、ニューロンの分化の両方の一般とクラス固有のメカニズムを解明するための強力な遺伝的モデルとなっている。 4つの主要なDAニューロンのクラス（I - ^IV）1があります。彼らは、増加する樹状突起の複雑さの順に名前が付けられ、それらの分化^2-10の遺伝的制御のクラス固有の相違点を持っています。 1）それが2）、DAニューロン樹状突起が広がる、ショウジョウバエで利用できる強力な遺伝学的ツールを活用することができますので、DA感覚システムは、樹枝状形態の制御^11から13の背後にある分子メカニズムを調べるために実用的なモデルです。光学的にCLEの下にだけ2次元のそれは容易にin vivoでの高分解能で可視化することAR幼虫のクチクラ、3）樹枝状形態におけるクラス固有の多様性は、単純な比較高度に分岐した樹枝状の木の形成を制御する重要な要素を見つけるために比較分析を容易に、そして4）樹状あずまや固定観念別のDAニューロンの形状は、形態学的統計分析を促進する。

DAニューロンの活動は、幼虫の運動中枢パターン発生器^14から16の出力を変更します。別のDAニューロンのクラスは、異なる感覚モダリティを持っており、それらの活性化は^、14,16-20異なる行動反応を誘発する。さらに別のクラスには、腹側神経索のショウジョウバエ幼虫の中枢神経系^（VNC）21に型通りに軸索投射を送る。これらの予測は、樹状フィールド^7,22の体壁のDAニューロンの感覚モダリティと位置の両方の地形表現で終了、23。 DA軸索突起のよって検査は、地形図^7,22,23、だけでなく、簡単な回路を変調幼虫の運動^{14から17まで}の配線の基礎となるメカニズムを解明するために使用することができます。

ここではMARCM（抑制性細胞マーカーを持つモザイク解析^）1,10,25とFLPアウト^22,26,27技術（図1に要約）を介して²⁴マーキングDAニューロンを生成し、遺伝的モザイクを分析する実用的なガイドを提示する。

プロトコル

試薬の1.Preparation

1. のCa ^{+ +} -フリーHL3.1生理食塩水^28を準備する。
   1. mMで：70のNaCl、5のKCl、20のMgCl _2、10飽和NaHCO _3、5 HEPES、115スクロース、および5トレハロース、pHは7.2。滅菌濾過し、4℃で保存します。
      注：CA ^{+ +} - free溶液は、解剖時の筋収縮を防ぎます。
2. ポリ- L -リジン（PLL）カバースリップを行います。
   1. -20℃で4.2ミリリットルの水に100mgのPLLを溶解し、エッペンドルフチュー​​ブや凍結で300μlアリコートを作る
   2. コーティングのカバースリップは、最初の雪解けアリコートを、のddH ₂ Oで10ミリリットルにそれを起動してコダックフォト-フローの20μlのを追加する前に、最終的なPLL濃度は0.7 mg / mlのです。
   3. PLL溶液中で30分のための水没のカバースリップは、削除して乾燥させ、その後水と乾燥で簡単にすすいでください。二回繰り返します。治療をカバースリップ最後の約1ヶ月。

2。遺伝的交雑

1. ToはMARCMのク....

ディスカッション

ショウジョウバエ幼虫のDAニューロンモデルは、制御のニューロンの形態と回路形成そのメカニズムを調べる一つの優れた遺伝システムを提供します。 MARCMは、一般的に標識のためにと体DAニューロンのクローンを生成するために使用されます。 MARCMのために私達はどちらか汎神経（例えば、Gal4の ^C155）またはDAニューロン固有のドライバを使用してください。汎神経ドライバを直接使用すると、株式公開センターから広く利用可能ないくつかの銘柄を使用することが可能です。しかし、DA -ニューロン固有のドライバを使用すると顕著なクローンはCNSで生成されないので、有利であることができる、そしてそのようなクローンはDA軸索末端の解析を困難にすることができます。一般的に使用されるDA固有のGal4の行のリストは、下野ら^（2009）27で発見できます。 FLPアウトは、研究者が併用異所的に単一のラベルが付いたニューロンにGAL4 - UASのバイナリシステム³⁵と測定の形態を用いて遺伝子を発現する際に特に有用である。加えてイメージングD.......

材料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
SZX16蛍光解剖顕微鏡（GFPHQフィルター付）	オリンポス	SZX16
昆虫鉗子を生きる	FST	26030〜10
26ミリメートルXの76ミリメートルうつ病のスライドガラス	Toshinriko（株）	T8 - R004
Sylgard 184（またはSilpot 184）	ダウコーニング	3097358-1004
ポリ- L -リジン	シグマ	P - 1524	この製品は、最も効果的であることが証明され
DPX封入剤	シグマ	44581
ウサギ抗GFP	インビトロジェン	- 11122	希釈1:500
ラット抗CD8	Caltag	5H10	希釈1:200
マウス抗CD2	ABD serotec	MCA443R	希釈1:700
マウス抗Fasciclin2	DSHB	1D4	希釈午前1時10分