イメージングマスサイトメトリーのための組織免疫染色

要約

このビデオでは、マスサイトメトリーをイメージングするための組織サンプルの調製について説明しています。まず、この組織をプロセシングして、抗原エピトープのマスクを解除し、細胞を透過化し、非特異的な抗体結合部位をブロックします。次に、組織を金属標識抗体カクテルと核染色剤でインキュベートします。最後に、処理した組織サンプルを光学スキャナーを使用して画像化します。

プロトコル

1. 組織の前処理:

フレッシュフローズンティッシュの場合:

1. ガラス製のCoplinジャーを-20°Cの冷凍庫に少なくとも1時間置いてから使用してください。
2. スライドを-80°C冷凍庫から取り出し、-20°C冷凍庫のガラス製Coplinジャーに少なくとも15分間入れます。
3. ドラフトの下で、アンプルカッターを使用して16%パラホルムアルデヒド(PFA)ガラスアンプルを開きます。割れたガラスは適切に廃棄してください。
4. 10 mLの16% PFAと30 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をプラスチック製のCoplinジャーに加えます。PBSが4°Cに事前に冷却されていることを確認してください。
5. この溶液を4°C冷蔵庫に少なくとも15分間移します。
6. 15分後、スライド付きのガラス製Coplinジャーを4°C冷蔵庫に10分間移します。
7. スライドをガラス瓶から冷たい4%PFA溶液が入ったプラスチックCoplin瓶に移します。
8. スライドを4%PFAで冷蔵庫内で30分間固定します。
9. スライドを室温のPBSでそれぞれ5分間3回すすぎ、サイクル間で十分にすすぎます。

FFPE組織の場合:

1. まず、正に帯電した標準顕微鏡スライドに5 μmのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片を取り付けます。
2. スライドを60°Cで1時間加熱して脱ろうします。
3. スライドを取り外し、室温で約5分間冷却します。
4. スライドをスライドメーラーに入れ、キシレンバスで3分間、2回すすぎます。
5. 再度、スライドを100%エタノールで1分間、2回すすぎます。
6. 同様に、スライドを95%エタノールと70%エタノールでそれぞれ1分間すすぎます。
7. 最後に、蒸留水で3分間2回すすぎます
   手記：Hyperionは、スライドエッジから2mm以内でアブレーションを行うことができず、組織をできるだけ中央に配置することができません。

2. 熱誘起エピトープ賦出 (HIER)

1. トリス-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)pH9緩衝液を調製します。
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer は 100 倍で購入し、1 倍に希釈して高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 水にします。
   2. 例:2.5mL Abcam ab93684 を 247.5 mL HPLC 水に入れます。
      手記： 6か月以上経過したバッファーは使用しないでください。
2. スライドを加熱するためのデクローキングチャンバーを設置します。まず、チャンバーの底に500mLの水道水を入れます。次に、サイドコンテナの両方に250mLの水道水を追加し、中央のコンテナに200mLの水道水を追加します。
3. スライドを3枚まで5枚入れるメーラーに入れます。
4. 組織が完全に沈むまで、スライドメーラーにHIERバッファーを充填します。手記： スライドメーラーの上部に小さな穴があり、蒸気を排出して加圧を防ぐようにしてください。
5. 「プログラム4」を95°Cで20分間実行します。
6. その間、後続のステップのためにインキュベーションチャンバーを事前に温めます(ステップ3.5を参照)
7. インキュベーション後、メーラーを取り外し、蛇口から冷水を入れた浴槽に入れます。
8. 5分間冷まします。
9. メーラーからバッファーの半分を取り外し、蒸留水と交換します。5分間冷まします。
10. バッファーを徐々に取り外し、水量を2回増やし、それぞれ5分間の冷却時間を設けます。
11. 最後に、スライドを100%蒸留水ですすいでください。

3. 非特異的結合のブロック

1. ブロッキングバッファー(トリスバッファー生理食塩水またはTBS、0.1% Triton X-100、3% ウシ血清アルブミンまたはBSA)を調製するには、10% BSAを含むTBS150uLを0.1% Triton X-10.
   を含むTBS150uLに加えます。 手記： BSAが10%のTBSは-20°Cで保存され、毎回新鮮に解凍する必要があります。
2. スライドメーラーまたはCoplinジャーを使用して、TBS、0.1%Triton X-100でスライドを5分間2回洗浄します。
3. メーラーからスライドを取り出し、Kim ワイプを使用して PAP サークルの外側のバッファーを削除します。~1分ほどで少し乾かします。
4. P200を使用して、組織を覆うのに十分な量のブロッキングバッファーを組織の上に数滴加えます。PAPラインは、液体を組織の上に保持する必要があります。
   手記： バッファーがPAPサークルに閉じ込められていない場合は、後で抗体が失われないように、組織の周りにPAPサークルを再描画します。
5. スライドを室温で湿度チャンバー内で1時間インキュベートします。
   手記：空のピペットチップボックスは、湿度チャンバーに適しています。底に少量の水道水が存在することを確認してください。

4. 金属標識抗体による染色

1. 金属標識抗体を4°Cから取り出し、10,000 x Gで1分間遠心分離します。
2. TBS、0.1% Triton X-100、および 1% BSA 混合物中の抗体マスターミックスの最適希釈液の調製
   注:a)各抗体の最適な希釈は実験的に決定する必要があり、イメージングマスサイトメトリー実験を成功させるための最も重要なステップの1つです。Excelスプレッドシートを使用して体積を計算します。抗体のコストのために必要以上にわずかに多く作るだけです。例えば、ブロッキングバッファーが200uL必要な場合は、250uLのマスターミックスを作成します。b)マスターミックスは、ブロッキングステップ中の各実験で新鮮に調製する必要があります。
3. インキュベーション後(ステップ3.5を参照)、スライドをインキュベーターから取り出します。
4. キムワイプでスライドを垂直および水平に軽くたたいて、余分なブロッキングバッファーを取り除きます。これにより、組織にブロッキングバッファーが残りますが、そのほとんどが失われます。
5. ~1分ほどで少し乾かします。
6. スライドを4°Cの湿度チャンバーに置き、平衡化させます。
7. 次に、抗体マスターミックスを組織に慎重にピペットで移し、溶液がPAPサークル内に含まれるように細心の注意を払います。
8. 湿度チャンバーを閉じ、4°Cで一晩インキュベートします。
9. 一晩インキュベートした後、スライドを4°Cから取り出し、Kimワイプでスライドを垂直および水平に軽くたたいて余分なマスターミックスを取り除きます。
10. スライドをメーラーまたはCoplinジャーに入れ、0.2% Triton X-100を添加したリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで5分間2回洗浄します。
11. 次に、スライドをPBSで5分間、2回洗います。スライドを取り外し、約1分間乾かします。

5. DNAインターカレーション

1. DNAインターカレーションの場合は、Intercalator-IrをPBSで1:1000に希釈します。
2. 希釈したインターカレーターを組織に慎重にピペットで固定し、溶液がPAPサークル内に含まれていることに細心の注意を払います。
3. ブロッキングに使用した湿度チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。
4. その後、スライドをKimワイプで縦と横に軽くたたいて、余分なIntercalator-Ir色素を取り除きます。
5. スライドをメーラーまたはCoplinジャーに入れ、HPLC水でそれぞれ5分間2回洗います。
6. スライドをデシケーターで5分間乾燥させてからスキャンします。

6. イメージスキャン

1. スライドスキャンの場合は、超硬チップガラスエッチャーを使用して、スライドに4つのかすかなXを引っ掻きます。正確なティーチングポイントにより、最適な画像登録が可能になります。
   手記：端に近づきすぎないでください。
2. フラットベッドドキュメントスキャナーを使用して、1200ドット/インチ以上でスキャン
します
3. この画像をスライドの境界線にできるだけ近づけてトリミングし、フラッシュドライブに保存します。
4. 画像同時登録は、ファイル名に「Pre_IMC」を付けてHamamatsu NanoZoomerでスライドをスキャンします。

結果

図 1: イメージングマスサイトメトリーのための組織免疫染色手順の概略図

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
機器
コプリンジャー
通気孔付きプラスチック5スライドメーラー
抗原賦活化装置(デクローキングチャンバー)
スキャナー
化学品および酵素:
キシレン
200プルーフエタノール
HPLC水
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER バッファー
TBS系
TBSと0.1%トライションX-100
TBSのBSAは10%
PBSの
0.2%Trition X-100のPBS