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方法論記事

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

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DOI:

10.3791/3125

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2011年11月13日

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

この記事について

サマリー

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。

要約

次世代シーケンシング、マイクロアレイ、qRT-PCRなどの技術的プラットフォームによるアプローチは、分子調節の広範な理解を深める上で大きな期待が寄せられています。高解像度RNAシーケンシング（RNA-Seq）1などのより新しいアプローチは、相対的な転写産物レベル、選択的スプライシング、マイクロRNA2-4など、組織または状態特異的な発現に関する新しく広範な情報を提供します。個別の組織内、あるいは表現型が異なる個体群間での比較全トランスクリプトームプロファイリング5にRNA-Seq法を用いることで、正常および異常な生理状態の両方に関与する分子メカニズムを解明するための新たな道が開かれます。最近では、ヒトの脳組織を用いて全トランスクリプトームプロファイリングが行われ、疾患の進行に関連する遺伝子発現の差異が特定されています6。しかし、哺乳類の研究において、次世代シーケンシングの活用はまだ十分に普及していません。

マウスモデルを用いた遺伝子発現研究において、レーザーキャプチャーマイクロディセクション（LCM）による試料採取を用いた、様々な脳核における特異的なプロファイルが報告されています7,8。LCMは単一細胞や個別の脳領域という高精度な試料収集を可能にする一方で、LCM法による総RNA収量が比較的少ないため、マウス脳組織におけるRNA-Seqやその他のプロファイリングアプローチに適用する場合、収量が不十分となる可能性があり、最適ではない試料増幅ステップが必要になることがあります。本稿では、マウス脳の特定領域からのマイクロディセクションおよび総RNA抽出のためのプロトコルを提示します。径が固定された組織コーラーを用い、個々のマウス脳の750-μm連続冠状切片から13箇所の組織を分離します。組織マイクロパンチ試料は直ちに凍結し、保存します。総RNAは、磁性ビーズを用いた総RNA単離技術を用いて試料から得られます。得られたRNA試料は、下流の発現プロファイリングに使用するのに十分な収量と品質を有しています。このマイクロディセクション戦略は、個別の脳領域から総RNAを得るための既存の試料収集戦略に代わる実行可能な選択肢となり、新たな遺伝子発現の発見への可能性を広げるものです。

プロトコル

1. サンプリングのセットアップと準備

  1. Earle'sバランス塩溶液（EBSS）に、重曹（EBSS 100 mLあたり0.44 g）およびグルコース（EBSS 100 mLあたり0.884 g）を添加する。9オートクレーブ可能なスクリューキャップ付きボトルまたはフラスコを用いて、EBSSをDEPC（EBSS 100 mLあたり0.1 mL）で37 °Cで12時間以上処理する。
  2. 5 ¾インチのガラス製パストゥールピペットを1000 mLのガラスビーカーに入れ、刷毛（アーティストブラシ）を剛毛部分を上にして100 mLのガラス製メスシリンダーに入れます。十分な量のDEPC溶液（ddH2O 100 mLあたり0.1 mL）を加えます。2それぞれピペットとブラシを覆います。ビーカーとメスシリンダーをアルミホイルで覆い、37 °Cで少なくとも12時間インキュベートします。
  3. DEPCで12時間インキュベートした後、DEPC処理したすべての材料を特定の温度まで加熱し、 >100 °Cで少なくとも15分間加熱する。EBSSを除去し、4 °Cで保存する前に室温まで冷却する。ddH2Oを注ぎ2ビーカーとメスシリンダーから離し、引き続き～でインキュベートします。 >材料が乾燥するまで100 °Cで加熱する。取り出して室温まで冷却し、後で使用するために保存する。
  4. 実験当日、すべての作業表面をRNaseZapで処理してください。
  5. EBSSを40 °Cに設定したウォーターバスに入れ、保持する。EBSSを緩衝し酸素化するため、95%/5% O2/CO2混合ガスを導入する。2/CO2 ガスチューブをRNaseフリーのパスツールピペットに入れ、そのピペットをEBSSの中に挿入します。EBSS容器の開口部を密閉してください。
  6. 脳組織の連続切片作成に向けて、Stoelting組織スライサーのセットアップを行う。組織スライサーの上面と底面をRNaseZapで処理する。Whatman #4フィルターペーパーを長方形に切り、組織チョッパーのプレキシガラス面に貼り付ける。両刃のカミソリ刃をチョッパーアームに取り付ける。マイクロメーターをゼロに設定し、カミソリ刃がフィルターペーパーは切断するが、プレキシガラスプレートは切断しない高さになるよう、チョッパーアームの最低高さを調整する。
  7. RNaseフリーの60x15 mm細胞培養ディッシュ、Harris Uni-Core組織コーラー、冠状断脳切片のマイクロサンプルパンチング中のEBSS酸素供給用ガスチューブ装着用200 μL RNaseフリーマイクロピペットチップ、湾曲剪刀、ドライアイス、および組織回収用チューブを含む、マイクロダイセクションに必要なすべての追加資材を準備する。チューブをドライアイス上に配置する。

2. 脳の摘出および冠状断切片作成

  1. マウスをDecapiConeに入れ、齧歯類用ギロチンで斬首する。DecapiConeから頭部を取り出し、平らな面に置く。メスを用いて、鼻孔から尾側へ約3 mmの地点から頭蓋骨の中線に沿って皮膚を切開する。皮膚片を外側に剥がし、頭蓋骨と眼窩を露出させる。
  2. 彎曲剪刀を用いて両側の視神経を切断し、眼との接続を断つ。後頭骨と間頭頂骨を慎重に砕き、背側の頭頂骨および前頭骨を取り除いて頭蓋腔を開く。骨鉗子を用いて鼻骨と涙骨を砕き、嗅球を露出させる。彎曲剪刀を用いて、嗅球を吻側脳から切り離す。後脳を保持したまま全脳を摘出する。脳を60 x 15 mmのRNaseフリーCellstar細胞培養ディッシュの上部に置く。組織サンプリング作業台へ移動させる。
  3. RNaseフリーピペットを用いて、組織チョッパーに取り付けられたフィルターペーパーをEBSSで控えめに湿らせる。脳組織をEBSSで濡らす。
  4. 脳を組織チョッパーに移し、適切な向きにセットする。注：脳の腹側表面がフィルターペーパーに接するように配置すること。中線（大脳縦裂）がチョッパーの刃に対して垂直であり、脳の吻側端が刃に接している必要がある。
  5. DEPC処理した絵筆を用い、脳の背側表面に軽く圧力をかけて脳を固定する。脳を固定したまま、ブレードホルダーレバーを組織表面の背側から約4-5 cmまで持ち上げ、その位置で保持する。脳表面から筆を離し、マイクロメーターで750 μmにダイヤルを合わせる。レバーを落とし、組織をチョッピングして750 μmの冠状切片を作成する。
  6. チョッパーの刃を静止させた状態で、絵筆を転がすように動かし、組織切片を刃の表面から優しく掃き出す。組織切片を速やかにペトリディッシュ内の酸素飽和EBSSに入れる。別の研究者がステップ3.1を開始することができる。
  7. 吻尾方向の全平面にわたって連続的な脳切片が得られるまで、ステップ2.5と2.6を繰り返す。

3. 脳領域のマイクロダイセクション

  1. 組織のマイクロダイセクション中にサンプルの照明が遮られないよう、ライティングを調整します。マイクロダイセクション中の組織に緩衝化され酸素が供給された環境を維持するため、95%/5%のO2/CO2混合ガスの位置と流量を調整します。
  2. 目的領域を含む脳の冠状切片を特定します。絵筆を用いて、脳切片をペトリ皿の底に平らに配置します。Table 1またはその他の参考文献に基づき、適切な直径の組織コーラーを選択します。絵筆で冠状切片を固定しながら、組織コーラーの切断チップを組織切片の表面まで降ろします。
  3. 圧力をかけながら、組織コーラーのチップを組織切片に貫通させ、ペトリ皿の底にしっかりと押し付けます。回転させるように円を描く動作を行い、目的領域が周囲の組織から切り離されていることを確認します。組織コーラーを組織切片から慎重に持ち上げ、マイクロパンチを放出させ、EBSS中で浮遊させます。
  4. 絵筆を用いて、組織マイクロパンチを直ちにドライアイス上の-80 °C安定保存チューブに移します。組織はチューブの側壁に容易に付着します。マイクロサンプルが入ったチューブをドライアイスに戻します。
  5. 各目的の脳領域について、ステップ3.2から3.4を繰り返します。

4. 組織の保存

  1. マイクロダイセクションが完了したら、VisionMateスキャナーシステムを使用して、各サンプルが入ったTrakMatesチューブのバーコードを記録します。96スロットのTrakMatesチューブラックが満たされたら、速やかにラックをスキャンし、RNA抽出まで組織サンプルを-80 °Cのフリーザーに直ちに保管してください。

5. 総RNAの抽出

  1. RNaseZapを用いて、RNaseフリーのワークスペースを準備します。MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10に従い、十分な量の磁気ビーズミックス（Bead Mix）および溶解・結合溶液（Lysis/Binding Solution）を調製します。
  2. 組織サンプルを-80 °Cのフリーザーから取り出し、チューブを直接ドライアイス上に置きます。
  3. サンプルが入ったTrakMatesチューブに、溶解・結合溶液を100 μL加えます。ペレットミキサーにヌクレアーゼフリーの0.5 mlチューブ用ペッスルを取り付け、組織を均質化します。低吸着ヌクレアーゼフリーピペットチップを用いて、均質化したサンプルをラウンドボトム96ウェル組織培養プレートのウェルに分注します。直ちに低吸着ヌクレアーゼフリーピペットチップを用いて100%イソプロパノールを60 μLサンプルに加え、ピペッティングを3〜4回繰り返して混合します。
  4. 低吸着ヌクレアーゼフリーピペットチップを用いて、ビーズミックスを20 μLサンプルに加えます。ピペッティングを3〜4回繰り返して混合します。
  5. すべての組織サンプルに対して、ステップ5.3〜5.4を繰り返します。
  6. III.A.2以降のMagMAX-96 Total RNA Isolation Protocolの手順に従い、全RNA抽出を完了させます。注： 他の磁気ビーズを用いた全RNA分離キットも市販されていますが、本研究では検討していません。各製品を用いた全RNA分離の詳細については、製造元のキットマニュアルを参照してください。
  7. 得られた全RNAの純度と濃度を、NanoDrop 3300分光光度計またはその他の微量分光光度計／蛍光光度計を用いて測定します。

6. 代表的な結果：

脳領域/核組織コアラー径 (mm)全RNA (ng/μL)260/280比
前頭前皮質2.027.031.99
側坐核1.06.262.77
線条体1.527.942.19
帯状皮質1.529.052.07
視床下部 - 室傍核 / 視交叉上核 (PVN/SCN)2.040.342.03
視床2.034.402.00
視床下部 - 背内側核 / 腹内側核 (DMH/VMH)2.044.832.05
扁桃体1.010.061.89
海馬 - Ca 2/31.57.312.32
海馬 - CA1/歯状回1.55.202.24
中脳辺縁灰白質1.048.212.02
背側縫線核1.06.562.18
網状体2.035.352.27

表1. 微小解剖されたマウス脳領域の一覧と、それぞれの最適な組織コア径、代表的な全RNA収量および純度。吻側から尾側の順に記載された13の微小解剖脳領域は、サイズと方向が異なる。PVN/SCNマイクロパンチには、視索前核前内側部、室傍核の一部、室傍下帯、およびその他の小細胞ニューロンが含まれる。視床マイクロパンチには、PVN/SCNマイクロパンチ領域と同じ冠状面に位置する視床前核が含まれる。DMH/VMHマイクロパンチには、背内側核と腹内側核の間に位置する副大細胞核およびその他の小細胞ニューロンが含まれる。扁桃体サンプルには、中心核と基底外側核の両方の亜領域が含まれる。RNA収量および260/280比は、各脳領域から得られた測定値を例示するために、それぞれの微小解剖サンプルから得られた単一の値を示している。

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ディスカッション

このプロトコルには、細心の注意と検討を要する重要なステップが数多くあります。まず、各目的領域を採取するために適切な組織コーラーの直径を選択する必要があります。表1に示した組織コーラーの直径は、記載された脳領域の採取に適していますが、各研究者は、自身の目的とする組織を最適に採取するために適切なサイズの組織コーラーを決定してください。次に、本手法で報告している冠状切片の厚さ（750 μm）は、様々な遺伝的背景を持つ成体マウスにおいて、目的の脳領域（表1）を特定するのに最適であると実験的に決定されました。神経解剖学的な指標を用いて各目的領域の境界を確認しますが、これは個体間で異なります。組織の厚さは変更可能ですが、切片の厚さを500 μm以下に設定すると、技術的な困難が生じ、このマイクロダイセクション法の有用性が損なわれます。最後に、動物の断頭から脳の切断完了までの最適な所要時間は5分です。この時間までに、すべての冠状切片を酸素供給済みのEBSS培地に入れておく必要があります。

全RNA抽出に磁気ビーズ技術を用いることで、カラムベースのRNA抽出が不要と...

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開示事項

利益相反はありません。

謝辞

本研究は、国防高等研究計画局（DARPA）および陸軍研究局（ARO）の助成（授与番号：W911NF-10-1-006）を受けたものです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Isotemp 102 ウォーターバスFisher Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
ラボ用ローテーター（オービタルシェーカー）Thermo Fisher Scientific, Inc.2314 –- 1CEQ
ペレットミキサーVWR international47747-370
RNaseフリー0.5 mLペッスルVWR internationalKT749521-0590ヌクレアーゼフリー
ジエチルピロカボネート (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
両刃カミソリ刃Stoelting Co.51427
St–手動マイクロメーター付き組織スライサーStoelting Co.51425
2/0号 丸筆’ブラシプリンストン・アートブラシ4350R
Harris Uni-Core 組織コア採取器 (0.75 mm)Ted Pella, Inc.15072
Harris Uni-Core組織コア採取針（1.0 mm）Ted Pella, Inc.15099
Harris Uni-Core組織コア採取器（1.5 mm）Ted Pella, Inc.15075
Harris Uni-Core組織コア採取器 (2.0 mm)Ted Pella, Inc.15076
ギロチン（切断機）Braintree Scientific, Inc.RG-100
デカピコーン（DecapiCones）Braintree Scientific, Inc.MDC-200
HyClone Earle’ハンクス平衡塩溶液 (EBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30029.02
25 mLピペットCorning4489ヌクレアーゼフリー
epT.I.P.S. 低吸着デュアルフィルターピペットチップ, 20μL — 300 μLEppendorf0030 077.636
キャップ付きTrakMatesスクリューキャップチューブThermo Fisher Scientific, Inc.3741
VisionMate ワイヤレス2DバーコードリーダーThermo Fisher Scientific, Inc.3122MTX
VisionMate SR シングルラック 2DバーコードリーダーThermo Fisher Scientific, Inc.3115
1-200 μL ユニバーサルフィットピペットチップCorning4864ヌクレアーゼフリー
Cellstar細胞培養ディッシュGreiner Bio-One628160ヌクレアーゼフリー
Greiner Bio-One 96ウェルポリスチレン製Cellstar組織培養プレート、U底USA Scientific, Inc.5665-0180ヌクレアーゼフリー
#4 ろ紙Whatman, GE Healthcare1004 150
シリコンバルブ式安全ピペットフィラーFisher Scientific13-681-102A
NanoDrop 3300分光光度計Thermo Fisher Scientific, Inc.ND-3300

参考文献

  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
  3. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
  4. Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
  5. Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
  6. Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
  7. Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
  8. Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
  9. Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
  10. Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.

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再版と許可

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