トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

サマリー

マウスの脳領域のRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織収集戦略が必要です。 ここでは、冠状脳切片と組織コアラー支援マイクロダイセクションの両方を使用するプロトコルについて説明します。 得られたサンプルから得られた全RNAの収量と品質は、概説した分析法の有用性を裏付けています。

要約

技術プラットフォームとして、次世代シーケンシング、マイクロアレイ、qRT-PCRなどのアプローチは、分子制御の幅についての理解を深める上で大きな期待が寄せられています。 高分解能RNAシーケンシング(RNA-Seq)¹などの新しいアプローチは、相対的な転写産物レベル、選択的スプライシング、マイクロ^RNA2-4など、組織特異的または状態特異的な発現に関する新しい広範な情報を提供します。RNA-Seq法を、離散組織内または表現型的に異なる個体群間の全トランスクリプトームプロファイリング⁵の比較に採用する見通しは、正常な生理学的状態と異常な生理学的状態の両方に関与する分子メカニズムを解明するための新たな道筋を提供します。 最近、ヒト脳組織に対して全トランスクリプトームプロファイリングが行われ、疾患の進行に関連する遺伝子発現の違いが特定されました⁶。 しかし、次世代シーケンシングの使用は、まだ哺乳類の研究に広く統合されていません。

マウスモデルでの遺伝子発現研究では、サンプル切除のためのレーザー捕捉顕微鏡(LCM)を使用したさまざまな脳核内の異なるプロファイルが報告されています^7,8。 LCMは、シングルセルおよび個別の脳領域の精度でサンプルを収集することができますが、LCMアプローチによる総RNA収量が比較的低いため、マウス脳組織のRNA-Seqやその他のプロファイリングアプローチには負荷がかかり、サンプル増幅ステップが最適とは言えない場合があります。 ここでは、マウスの脳の離散領域からのマイクロダイセクションとトータルRNA抽出のためのプロトコルを紹介します。 セット径組織コアラーは、個々のマウス脳の750μm連続冠状切片から13の組織を単離するために使用されます。 組織マイクロパンチサンプルはすぐに凍結され、アーカイブされます。 トータルRNAは、マグネティックビーズ対応のトータルRNA単離技術を用いてサンプルから得られます。 得られた RNA サンプルは、ダウンストリームの発現プロファイリングに使用するのに十分な収量と品質を備えています。 このマイクロダイセクション戦略は、離散的な脳領域から全RNAを取得するための既存のサンプル収集戦略に実行可能なオプションを提供し、新しい遺伝子発現発見の可能性を開きます。

プロトコル

1. サンプリングのセットアップと準備

1. アールの平衡塩溶液(EBSS)に重炭酸ナトリウム(100 mL EBSSあたり0.44 g)とグルコース(100 mL EBSSあたり0.884 g)を添加します⁹。EBSSをDEPC(EBSS100 mLあたり0.1 mL)で37°Cで少なくとも12時間、オートクレーブ可能なボトルまたはスクリュートップ付きフラスコで処理します。
2. 5 3/4インチのガラスパスツールピペットを1000 mLのガラスビーカーに入れ、毛を上に向けてアーティストのブラシを100 mLのガラスメスシリンダーに入れます。十分なDEPC溶液(100 mL ddH₂Oあたり0.1 mL)を、ピペットとブラシをそれぞれ覆うように追加します。ビーカーとメスシリンダーをアルミホイルで覆い、37°Cで少なくとも12時間インキュベー
トします。
3. DEPCと12時間のインキュベーションを行った後、すべてのDEPC処理材料を>100°Cの温度で少なくとも15分間加熱します。EBSSを取り外し、室温まで冷ましてから4°Cで保存し、ビーカーとメスシリンダーからddH₂Oを注ぎます。材料が乾燥するまで、>100°Cでインキュベートを続けます。取り出して室温まで冷まし、後で使用するために保管します。
4. 実験当日は、すべての作業面をRNaseZapで処理します。
5. EBSSを40°Cに設定したウォーターバスに置き、維持します。EBSSを緩衝および酸素化するには、ガスチューブをRNaseを含まないパスツールピペットに入れ、ピペットをEBSSに挿入して、95%/5%O₂/CO₂を浸潤します。EBSSコンテナの開口部を覆います。
6. 脳組織の連続切片化に使用するためのStoelting組織スライサーをセットアップします。ティッシュスライサーの上面と下面をRNaseZapで処理します。長方形のWhatman#4濾紙をティッシュチョッパーのプレキシガラス表面に取り付けます。 チョッパーアームに両刃のカミソリの刃を取り付けます。マイクロメータをゼロに設定し、チョッパーアームの最小高さを調整して、カミソリの刃が濾紙を切断できるようにしますが、プレキシガラスプレートは切断できません。
7. RNaseフリーの60x15 mm細胞培養ディッシュ、Harris Uni-Core組織コアラー、マイクロサンプルパンチング中に冠状脳切片のEBSS酸素化用のガスチューブに貼り付けるための200 μL RNaseフリーマイクロピペットチップ、湾曲したハサミ、ドライアイス、組織採取用のチューブなど、マイクロダイセクションに必要なすべての追加材料を収集します。チューブをドライアイスの上に置きます。

2. 脳の除去と冠状切片

1. マウスをDecapiConeに入れ、げっ歯類のギロチンを使用して斬首します。DecapiConeからヘッドを取り外し、平らな面に置きます。メスを使用して、鼻孔まで約3mm尾側から頭蓋骨の正中線に沿って皮膚を切り取ります。皮膚フラップを横方向にはがして、頭蓋骨と眼窩を露出させます。
2. 湾曲したハサミを使用して、両方の視神経を切断し、目への接続を切断します。後頭骨と頭頂間骨を慎重に壊し、背側頭頂骨と前頭骨を取り除いて頭蓋腔を開きます。ボーンロンジャーを使用して、鼻骨と涙骨を壊し、嗅球を露出させます。湾曲したハサミを使用して、吻側脳から嗅球を切り取ります。後脳をそのままにして脳全体を切除します。60 x 15 mmのRNaseフリーCellstar細胞培養皿の上部に脳を置きます。組織サンプリング作業面に移します。
3. RNaseフリーのピペットを使用して、EBSSで濾紙を付属のティッシュチョッパーに保存的に湿らせます。EBSSで脳組織を濡らします。
4. 脳をティッシュチョッパーに移し、適切な向きを設定します。注:脳は、腹面が濾紙の上に置かれるように配置する必要があります。正中線(半球間亀裂)はチョッパーブレードに対して垂直である必要があり、脳の吻側エッジはブレードに隣接している必要があります。
5. DEPC処理されたアーティストブラシを使用して、脳の背側表面に穏やかな圧力を加えることにより、脳を静止させます。脳を静止させたまま、ブレードホルダーレバーを背側組織表面から約4〜5cm上に持ち上げ、この位置に保持します。ブラシを脳表面から取り外し、マイクロメータを使用して750μmをダイヤルします。レバーを落とし、組織を切り刻み、750μmの冠状切片を作成します。
6. チョッパーブレードを静止させたまま、アーティストのブラシでローリングモーションを使用して、ティッシュ部分をブレードの表面からそっとスワイプします。直ちに組織切片をペトリ皿内の酸素化EBSSに入れます。2 人目の調査員は、ステップ 3.1 から開始できます。
7. 手順2.5と2.6を繰り返して、吻尾面全体で連続した脳切片を取得します。

3. 脳領域マイクロダイセクション

1. 組織顕微解剖中にサンプルの照明が妨げられないように、照明を調整します。O₂/CO₂ の 95%/5% 混合物の位置と流れを調整して、マイクロダイセクション中の組織の緩衝された酸素化された環境を維持します。
2. 関心領域を含む冠状脳切片を特定します。アーティストのブラシを使用して、脳の部分をペトリ皿の底に平らに向けます。表1またはその他の参考文献に基づいて、適切な直径の組織コアラーを選択します。アーティストのブラシで冠状組織切片を所定の位置に保持しながら、ティッシュコアラーの切断先端をティッシュ切片の表面に下ろします。
3. 圧力をかけながら、ティッシュコアラーの先端をティッシュセクションに押し込み、ペトリ皿の底にしっかりと押し下げます。ローリング円運動を使用して、関心領域が周囲の組織から解離していることを確認します。ティッシュコアラーを慎重に持ち上げてティッシュ切片から離し、マイクロパンチを解放してEBSSに浮かべます。
4. アーティストのブラシを使用して、ドライアイス上に保管された-80°Cの安定した保存チューブにティッシュマイクロパンチをすぐに堆積させます。組織はチューブの側面に容易に付着するはずです。マイクロサンプル含有チューブをドライアイスに戻します。
5. 関心のある脳の各領域について、手順3.2〜3.4を繰り返します。

4. 組織のアーカイブ

1. マイクロダイセクションが完了したら、VisionMateスキャナーシステムを使用して、サンプルを含む各TrakMatesチューブのそれぞれのバーコードを記録します。96スロットのTrakMatesチューブラックがいっぱいになったら、ラックをすばやくスキャンし、すぐに組織サンプルを-80°Cの冷凍庫に入れてRNA抽出します。

5. Total RNA抽出

1. RNaseZap を使用して RNase フリーのワークスペースを準備します。MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol¹⁰に記載されているように、十分な量の磁気ビーズミックスと溶解/結合溶液を調製します。
2. -80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出し、チューブを直接ドライアイスの上に置きます。
3. 100 μLのLysis/Binding Solutionをサンプル含有TrakMatesチューブに加えます。ヌクレアーゼフリーのチューブサイズ0.5mlの乳棒をペレットミキサーに取り付け、組織を均質化します。保持力の低いヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用して、均質化したサンプルを丸底の96ウェル組織培養プレート上のウェルに移します。すぐに、低保持ヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用して60μLの100%イソプロパノールをサンプルに加え、ピペッティングで3〜4回上下して混合します。
4. 20 μLのビーズミックスを、低保持のヌクレアーゼフリーピペットチップを使用してサンプルに加えます。ピペッティングで3〜4回上下させて混合します。
5. すべての組織サンプルについて、手順5.3〜5.4を繰り返します。
6. III.A.2から始まるMagMAX-96 Total RNA Isolation Protocolの手順に従って、Total RNA抽出を完了します。手記：その他の磁気ビーズ対応の全RNA単離キットは市販されています。ただし、この研究では検討されていません。各製品を用いたtotal RNA単離の詳細については、メーカーのキットマニュアルをご参照ください。
7. NanoDrop 3300分光光度計またはその他の小容量分光光度計/蛍光光度計技術を使用して、得られた全RNAの純度と濃度を測定します。

6. 代表的な結果:

銭 銭

脳領域/核	ティッシュコアラー径(mm)	全RNA(ng/μL)	260/280レシオ
前頭皮質	2.0	03月27日	1.99
側坐核	1.0	6.26	2.77
線条 体	1.5	27円94銭	2.19
帯状皮質	1.5	05月29日	2.07
視床下部 - 傍脳室核 / 視交叉上核 (PVN/SCN)	2.0	40円34	2.03
視床	2.0	34円40	2.00
視床下部 - 背内側核 / 腹内側核 (DMH/VMH)	2.0	44円83銭	2.05
扁 桃 体	1.0	10月06日	1.89
海馬 - CA 2/3	1.5	7.31	2.32
海馬 - Ca1/歯状回	1.5	5月20日	2.24
ペリアケダクトグレー	1.0	48円21銭	2.02
背側縫線核	1.0	6.56	2.18
網様体	2.0	35円35銭	2.27

表 1.顕微鏡で解剖したマウス脳領域を、それぞれの最適な組織コアラー径、代表的な総RNA収量、および純度で列挙します。吻尾側の順にリストされた13の微小解剖された脳領域は、サイズと向きが異なります。PVN/SCNマイクロパンチには、前内側傍心室核、脳室周囲核の一部、傍室下ゾーン、その他のパルボ細胞ニューロンが含まれます。視床マイクロパンチには、PVN/SCNマイクロパンチ領域と同じ冠状面に位置する視床前核が含まれます。DMH/VMHマイクロパンチには、背内側核と腹内側核の間に位置する副大細胞核と他のパルボ細胞ニューロンが含まれています。扁桃体サンプルには、中央サブリージョンとベースサイドサブリージョンの両方が含まれます。RNA収量と260/280の比率は、各脳領域から得られた測定値を示すために、それぞれのマイクロダイセクションサンプルから得られた単一の値です。

ディスカッション

このプロトコルには、細心の注意と検討が必要な重要なステップが数多くあります。 適切な組織コアラーの直径の選択は、関心のあるそれぞれの領域を除去するために決定する必要があります。 表 1 に示されている組織コアラーの直径は、リストされた脳領域の収集に適していますが、各研究者は、それぞれの関心のある組織を最適に収集するために適切なサイズの組織コアラーを決定する必要があります。 第二に、この方法で報告された冠状切片の厚さ(750μm)は、さまざまな遺伝的背景を持つ成体マウスの関心のある脳領域(表1)を特定するのに最適であると実験的に決定されました。 神経解剖学的ランドマークは、それぞれの関心領域の境界を確認するために使用され、個々の動物間で変化はありません。組織の厚さは変更される場合があります。ただし、切片の厚さを 500 μm 未満に選択すると、この顕微解剖法の有用性が損なわれる技術的な課題が生じます。 最後に、動物の首を切ってから脳切片が完了するまでの最適な時間は 5 分です。 この時までに、すべての冠状脳切片は酸素化されたEBSS培地にあるはずです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Isotemp 102 ウォーターバス	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNase Zap	Ambion	AM9782
ラボローテーター(オービタルシェーカー)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 –- 1CEQ
ペレットミキサー	VWR 国際	47747-370
RNase フリー 0.5 mL 乳棒	VWR 国際	KT749521-0590	ヌクレアーゼフリー
ジエチルピロカーボネート (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
両刃 カミソリ刃	Stoelting Co.	51427
セント–手動マイクロメーター付きLTING組織スライサー	Stoelting Co.	51425
2/0ラウンドアーティスト'S ブラシ	Princeton Art Brush	4350R
Harris Uni-Core tissue coreer (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Harris Uni-Coreティッシュスコアラー(1.0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Harris Uni-Coreティッシュスコアラー (1.5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Harris Uni-Coreティッシュスコアラー(2.0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
ギロチン	Braintreeサイエンティフィック株式会社	RG-100
デカピコーン	ブレインツリー・サイエンティフィック社	MDC-200
ハイクローン アール平衡塩水溶液(EBSS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)	SH30029.02
25 mLピペット	Corning	4489	Nuclease-free
epT.I.P.S.LoRetention Dualfilter ピペットチップ、20 —300 μ;L	Eppendorf	0030 077.636
TrakMates スクリュートップチューブ キャップ付き	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3741
VisionMate ワイヤレス 2D バーコードリーダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック社	3122MTX
VisionMate SR シングルラック 2次元バーコードリーダ	サーモフィッシャーサイエンティフィック社	3115
1-200 ΜL ユニバーサルフィットピペットチップ	Corning	4864	ヌクレアーゼフリー
Cellstar細胞培養皿	Greiner Bio-One	628160	ヌクレアーゼフリー
Greiner Bio-One 96ウェルポリスチレン Cellstar組織培養プレート、U-bottom	USA Scientific, Inc.	5665-0180	Nuclease-free
#4 Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1004 150
シリコンバルブ式安全ピペットフィラー	Fisher Scientific	13-681-102A
NanoDrop 3300 分光光度計	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300