疱疹状皮膚炎（DH）は、IgAおよび表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）の間に自己免疫反応を特徴とする慢性炎症性疾患です。 DHは、グルテン過敏性および/または腹腔患者の非常に小さな部分で開発しています。この研究の結果は、DHもidiopatic皮膚炎の症状とアカゲザルのホストで開発できることを示している。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
組織トランスグルタミナーゼ2（tTG2は）すでに部分的に消化された食物グルテンなどグリアジンのペプチドをdeamidates腸の消化酵素です。遺伝的素因のある個体では、tTG2は小腸壁1,2にtTG2抗体およびその直接堆積の生産によって特徴づけられる自己免疫応答をトリガします。このような抗体の存在は、セリアック病（CD）の主要な特徴の一つである。表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）はまた、CD患者のごく少数の自己抗原として機能することができるトランスグルタミナーゼファミリーの別のメンバーです。これらは比較的まれなケースでは、ETGは臨床的に疱疹状皮膚炎（DH）として知られる自己免疫反応（皮膚の発疹）をトリガします。 CDとDH発症の正確なメカニズムはよく理解されていないが、それが知られているtTG2とCDとDH患者3,4の両方から血清抗体によって認識することができる株式の抗原エピトープをETG。
アカゲザル ）（表1、図1および図2）の皮膚病変からの生検サンプルの共焦点顕微鏡検査は患部組織を研究するために使用されていました。一匹（EM96）でIgAとtTG2抗体（図3）のスペクトルの重複が実証された。ダブルポジティブtTG2 +型IgA +細胞の存在は、真皮乳頭の周りに、深い表皮に集中していた。これは、DHの患者3に記載された病変と一致している。 EM96は、グルテンフリー食事療法、皮膚炎だけでなく、tTG2に置かれたときに+型IgA +預金は消失し（図1-3）はもはや検出されなかった。皮膚炎は、EM96での食事グルテンの再導入（図示せず）に基づいて、しかし、再び現れた。関係のない皮膚炎を持つ動物を含む他のニホンザルでは、tTG2 +型IgA +預金は検出されなかった。その皮膚のtTG2の存在と一緒にEM96の皮膚炎のグルテンフリー食事療法に依存した寛解+型IgA +細胞は、DH -など、自己免疫を示唆しているこの条件の開発のためのメカニズム。これは、任意の非ヒト霊長類におけるDHのような皮膚炎の最初の報告である。
プロトコル
1。皮膚生検標本のコレクション
- 前に皮膚生検の手順に、tiletamine塩酸塩とzolazepam塩酸telazol混合物（フォートダッジアニマルヘルス、フォートドッジ、アイオワ州）の2.5 mg / kgの筋肉内で動物を麻酔。横臥位までは麻酔薬の投与から動物を監視し、それらのエンクロージャから取り外します。
- betadineスクラブとアルコールを交互に準備を無菌的にサイズ40のブレード（オスタープロフェッショナルプロダクツ、マックミンヴィル、テネシー州）でオスターゴールデンA5シングルスピード獣医クリッパーを利用し、興味の皮膚領域から髪を削除します。選択された生検のサイト上に滅菌有窓ドレープを固定します。
- わずかな圧力で時計回りに180度時計回りと反楽器を回転させながら生検パンチが皮下TIに真皮層を介してトランセクトまで、無菌テクニックを使用して、皮膚に対して4.0ミリメートルMiltexパンチ皮膚生検器具（Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州）を配置ssue。生検標本を取り出して、鉗子と皮下組織から無償で皮膚のtransected部分を把握する。
- 靭帯パターン3 / 8サークルカット針（Ethilon、エチコン、ジョンソン＆ジョンソンメディカルリミテッド、バークシャー、英国）に接続されている3から0ナイロン縫合糸で皮膚の欠陥を閉じます。すべての動物に術後鎮痛のための筋肉注射では0.01 mg / kgの塩酸ブプレノルフィン（ホスピーラ、レイクフォレスト、イリノイ州）を得た。
2。サンプル処理
- 慢性皮膚炎と健常対照から皮膚生検サンプルで作業はアカゲザル。二〜三（直径4 mm）の各動物からのサンプルを生検取得します。
- 24時間（Z -修正、Anatech（株）、バトルクリーク、ミシガン州）亜鉛ホルマリンで最初のサンプルを修正し、ASP300ライカの組織のプロセッサ（ライカマイクロシステムズ社に、30分間水で洗浄、70％エタノールで簡単に洗浄、および場所組織は70％、80％、95％および100％エタノール48の昇順グレードで脱水、バッファローグローブ、KS）キシレンの二つの変更（フィッシャー）に続いて、各（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA）を、分
- 室温で長期保存のためにパラフィンのメディア（フィッシャー）に埋め込みます。場所前の切片に20分間-20℃。ロータリーミクロトーム（HM325、Micromインターナショナル、ルドルフ、ドイツ）を用いて6μmの切片を作製します。帯電したスライド（フィッシャー）と一晩60℃での乾燥空気の上に置いてセクション。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）の標準方式（後述）で染色。
- 室温で30分間、2％パラホルムアルデヒド（USBコーポレーション、クリーブランド、オハイオ州）で二番目のサンプルを修正し、（PBS、ギブコ- Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、30％ショ糖の代わりに（フィッシャー）のために4時間、およびOCT凍結培地（サクラファインテック、トーレンス、カリフォルニア州）に埋め込みます。前の切片に20分間、80℃で保管してください。クライオスタットを（HM560、サーモサイエンティフィック、カラマズー、ミシガン州）を使用して15μmの切片を作製します。
3。 H＆E染色
- 埋め込みを脱パラフィンキシレンの三つの変更（フィッシャー）を通じて、DEDのセクションおよび傾斜ethanolsを通して水分補給をする：100％、95％の二つの変更、80％、蒸留水のいずれかの変更が、2分ごとの3つの変更を。
- 1分間のためのヘマトキシリン（リチャード - アラン科学、カラマズー、ミシガン州）で染色し、水道水を流しての簡単な洗浄によって従ってください。
- 6分間エオシン（シグマ）と対比。
- 95％と無水エタノール、キシレンの三つの変更で2分ごとにしてクリアを2回交換し、3分ごとに通過ステンド組織を脱水する。
- H＆E染色切片上Cytoseal封入剤を使用してマウントのカバーガラス（リチャード - アラン科学）。
4。病理組織学的評価
SPOTインサイトデジタルカメラ（デジタルインスツルメンツ社、ミシガン州、米国）との組み合わせで最大40倍の倍率とライカの顕微鏡 - 4を使用して光学顕微鏡下でH＆E染色生検皮膚切片を検査する。
5。免疫蛍光STAI寧
- 免疫蛍光染色のためのOCT -埋め込まれた皮膚切片で動作。染色する前に、PBSで20分が0.1％でOCTを削除すると、組織を透過性にトリトンX - 100（Sigma社）0.2％、魚皮ゼラチン（FSG、Sigma）を含むために浸漬。
- スライドを洗浄した後、加湿スライドチャンバー内で、室温で、1時間PBS - FSGで希釈した10％正常ヤギ血清（NGS、シグマ）、でインキュベートする。
- IgAとtTG2抗体の沈着を可視化するために、1時間に10％NGS - PBS - FSGで希釈した抗アカゲザルIgAおよびtTG2一次抗体、を使用してスライドをインキュベートする。
- 10分間PBS - FSGが続く10分、のためにPBS - FSG -トリトンX - 100（Sigma）で洗ってください。
- 1:1000希釈でのAlexa Fluor ®蛍光色素488（緑）、568（赤）または633（青）（Molecular Probes社 - インビトロジェン社）でタグ付けされた二次、アイソタイプ特異的抗体でインキュベートする。核DNAを可視化するToPro - 3色素を使用してください。抗体の希釈液として10％NGS - PBS - FSGを使用してください。
- 染色した組織切片をマウントするためにアンチクエンチング溶液（Sigma）を使用してください。
6。共焦点像
488nmでアルゴン - クリプトンレーザー（緑）、568 nmのクリプトンレーザー（：3つのレーザー（利用可能な励起のための6行）を搭載したライカTCS SP2共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ、ヴェッツラー、ドイツ）でイメージングを実行する赤）とスペクトルの遠赤側からは見えませんからスパン633 nmの（青）、ヘリウム - ネオンレーザー。非標識組織アーキテクチャの評価のための記録の微分干渉コントラスト（DIC）のイメージ。
7。代表的な結果
tTG2およびIgA抗体の両方でETGの肯定的な認識の例を図に示します。 3A。人間の患者の状況とアカゲザルでもグルテン感受性CD -様よりDHのような皮膚炎の非常に低い有病率に起因すると一貫性、皮膚生検標本のほとんどは、翔に期待されていますワットtTG2抗体とがtTG2 +型IgA +二重陽性細胞（図4）の存在なしに陽性反応。これらのDH -無関係な微生物起源の皮膚炎の場合を含む場合は、、いくつかの単一陽性型IgA +上皮の下に散らばって細胞がtTG2およびIgA標識マーカー（図3B及び4）の間にないスペクトルの重なりを明らかにする。したがって、それは病理組織学的評価（図2）と、他の、より一般的な皮膚炎の原因となる薬剤も特定できない場合にのみ、焦点が続く臨床検査（図1）、で始まる、提案されたテスト手順の順序を維持することが重要です。 tTG2とIgAについて染色した皮膚生検の顕微鏡検査が保証されている。単独で臨床的および/または病理組織学的評価は、この条件の肯定的な診断には十分ではありません。このような場合で、二重陽性（tTG2 + IgAの+）細胞が真皮乳頭の領域の周囲に識別され、DHのような皮膚炎の診断を発行することができます。食事のグルテンのような場合には、撤退とグルテンフリー食事療法の投与は、皮膚炎の症状を緩和するために推奨されます。
図1前EM96マカクの鼠径部（A）と後（B）5週間の食事グルテンの撤退。食事グルテンの再導入は、皮膚炎の再現（C）と一致した。
図2。HEは、前に収集EM96マカク皮膚生検の染色（A）と後（B）9週間のための食事グルテンの撤退。 ：上皮は角化細胞の厚い表層地殻変性好中球を浸透して（上皮細胞の7月15日層）厚く。好中球は上皮の内側にも表示され、リンパ球、形質細胞、及び真皮上層の付属器周囲組織球の中程度の数値と混合されています。 B：一部hyperkeratOSISがまだ存在する、上皮の厚さは、真皮上層の最小限のリンパ形質細胞の浸潤と（4-7層）正規化されています。 C：無リンパ形質細胞の浸潤とFR56ニホンザルからのノーマル腹部の皮膚は、、比較のために含まれています。倍率20倍。
図3。前に収集EM96マカク皮膚生検の共焦点顕微鏡像（A）と後（B）9週間のための食事グルテンの撤退。 ：IgAの染色（緑）、tTG2（赤）とToPro - 3核DNAマーカー（青）。 IgAとtTG2の共局在は皮膚papilaeの周辺に黄色で表示されます。 B：グルテンフリー食には、いくつかの上皮下のIgAがまだ存在している間tTG2（赤）、（緑）上皮内にはIgAを示していないとToPro - 3核DNAマーカー（青）の9週間後に採取した皮膚サンプル。
図4。 動物が慢性的（DH -無関係）皮膚炎の症状を示すしている間に収集GI24アカゲザルの皮膚生検の強い>共焦点顕微鏡画像。 IgAの染色は赤で緑、tTG2にあり、ToPro - 3核DNAマーカーが青になります。赤と緑のマーカーの間には広範なスペクトルの重なりが検出されない間、tTG2 +細胞は、上皮下に上皮、いくつかの型IgA +細胞の内部に存在する。
| 動物タグ | セックス [M / F] | 年齢 [年] | 臨床症状 | プラズマtTG2 抗体 | ダイエット [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | 健康 | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | 健康、時折の下痢 | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | 慢性特発性下痢 | - | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | 慢性皮膚炎 | + / - （ボーダーライン） | 1と2 |
| GI24 | F | 4.6 | 慢性皮膚炎 | - | 1 |
皮膚生検のコレクションのために使用される表1。TNPRCはアカゲザル
*ダイエット1 - 定期的なサルチョウ（グルテン含有）、ダイエット2 - グルテンフリー食
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
グルテン感受性の私達の新しく設立された非ヒト霊長類モデルは、最近の食事グルテン5,6によって引き起こされる腸の透過性の変化を研究するために使用されていました。プラズマtTG2抗体だけでなく、腸のtTG2 +型IgA +堆積物は、いくつかのグルテンに敏感なマカクザルで検出された。我々は最近、アカゲザルコロニーでは通常の（代謝/感染症）病因が確立できなかったニホンザルを、特発性皮膚炎のまれな事件を識別するので、本研究の目的は、評価することである場合tTG2 +型IgA +抗体の鉱床は、これらのまれなケースから皮膚サンプルで検出することができた皮膚炎の（表1）。
1:70と1:200 7の間のCDの範囲を示すものであるtTG2自己抗体の有病率。グルテン過敏性のマカクとの我々の研究では、キャプティブのtTG2抗体の有病率は、アカゲザル、ヒト集団から報告されたものに類似してニホンザルを示している。程度Oに影響を与えると思われる主な環境と遺伝的要因ヒトとニホンザルの両方にfをそのような有病率は、8,9を代役されています。 CD...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
著者は彼らの技術支援のためにアマンダタルドで、博士はモスタファBouljihad、ステファニーフィーリー、キャロルコイン、博士エリンRibka、博士はピートディディエとドロシーキュブラーに感謝します。この作品は、NIHの助成金R01 - DK076653とKSに3R01 - DK076653 - 02S1とTNPRC RR000164の基本オペレーティング助成金によってサポートされていました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬や機器の名前 | 会社 | カタログ番号/製品コード | （注） |
| 抗ヒトIgA - FITC * | シグマ、セントルイス、MO | F - 5259 | 1:100希釈率 |
| 抗ヒトtTG2 | サーモサイエンティフィック、カラマズー、ミシガン | MS - 300 - P1ABX | 1:100希釈率 |
| 抗マウスIgG1 ** | インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州 | - 21124 | 1:1000希釈率 |
| ToPro - 3 DNAプローブ*** | インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州 | T - 3605 | 1:1000希釈率 |
| ホルマリン亜鉛 （Z -修正） | Anatech（株）、バトルクリーク、ミシガン | 171 | |
| OCT凍結 中 | サクラファインテック、トーレンス、カリフォルニア州 | 4583 | |
| Cytoseal取り付け 中 | リチャード - アラン科学、カラマズー、ミシガン | 8312から4 | |
| アンチクエンチング ソリューション | シグマ、セントルイス、MO | P 3130 | |
| Ethilon （ナイロン縫合糸） | エチコン、ジョンソン＆ジョンソン、バークシャー州、イギリス | 663G | |
| Miltexパンチ皮膚生検器具 | Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州 | NA | |
| オスターゴールデンA5サイズ40ブレードとシングルスピードの獣医クリッパー | オスター製品、マックミンヴィル、テネシー州 | 78005-050 | |
| ライカのティッシュプロセッサ | ライカマイクロシステムズ株式会社。、バッファローグローブ、カンザス州 | ASP300 | |
| 回転式ミクロトーム | Micromインターナショナル、 ルドルフ、ドイツ | HM325 | |
| クライオスタット | サーモサイエンティフィック、 カラマズー、ミシガン | HM560 | |
| 共焦点顕微鏡 | ライカ、ウェッツラー、 ドイツの | TCS SP2 |
*フルオレセインイソチオシアネート
tTG2一次抗体の後に使用される**セカンダリ（のAlexa Fluor ® 568 -共役）抗体
**色素
参考文献
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
