包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

サマリー

レンチウイルス発現ベクターは安定し、哺乳動物細胞と生物全体を分割し、非分裂で異なるエフェクター分子またはレポーターコンストラクトを発現させるための最も効果的な車である。ここでは、pseudoviral粒子にlentivector発現構築物をパッケージ化するとpseudoviral粒子を用いた標的細胞を形質導入するためにどのようにプロトコルを提供しています。

要約

標準的なプラスミドベクターと同様に、エフェクターの一過性の発現を得るために低〜中程度の効率で細胞内にプラスミドの形でlentivectorsをトランスフェクトすることが可能です。 pseudoviral粒子にパッケージングレンチウイルス発現構築物は、しかし、さらに困難なトランスフェクションは、プライマリ、幹細胞などの細胞、および分化した細胞で、100％の伝達まで可能になります。また、レンチウイルスの配信は、典型的には、トランスフェクション試薬^1、2の毒性に起因する細胞死などの化学的トランスフェクションに関連付けられた特定の細胞応答を生成しません。標的細胞に導入する場合は、レンチウイルスコンストラクトはゲノムDNAに統合され、小さなヘアピンRNA（shRNA）は、cDNA、RNAまたはレポーター遺伝子^3、4の安定な発現を提供しています。安定的にエフェクター分子を発現する標的細胞は、発現ベクターなどピューロマイシンまたはGFPとして構築中に含まれる選択可能なマーカーを用いて単離することができます。後のPSウイルスの構造遺伝子が存在しないと、長い末端反復配列（LTRの）が伝達^5、6に自己不活性化するように設計されているため、eudoviral粒子は標的細胞に感染し、彼らは標的細胞内で複製することはできません。

効率的なレンチウイルスパッケージング^{1、5、6、7}のために必要な3つの主要コンポーネントがあります。

1. 包装に必要な遺伝的要素の一部が含まれレンチウイルス発現ベクターは、ウイルス発現の安定した統合は、ゲノムDNA中に構築し、エフェクターまたはレポーターの発現。
2. 組換えpseudoviral粒子に発現構築物のRNAコピーの転写およびパッケージングのために不可欠なタンパク質を提供するレンチウイルスパッケージングプラスミド。このプロトコルは、ウイルスコートタンパク質のためにHIVやFIVゲノムと水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質（VSV-G）からgag、polおよびREVのエンコードPPACKプラスミド（SBI）を使用します。
3. 293TN生成メンテナンスのためにセルを再選択するための有用な高タイターレンチウイルス生産とネオマイシン耐性遺伝子のために必要とされるSV40ラージT抗原を発現r細胞（HEK293細胞に由来する）。

ウイルス産生プロトコルの概要を図1に見ることができます。ウイルス産生は、レンチウイルス発現ベクターおよびパッケージングプラスミドと共トランスフェクト293TNプロデューサー細胞によって開始されます。ウイルス粒子が培地中に分泌されています。 48〜72時間後の細胞培養培地を収穫しています。細胞の破片は、細胞培養培地から削除され、ウイルス粒子は、濃度のPEG-それとを遠心分離によって沈殿させる。生産レンチウイルス粒子は、力価測定され、標的細胞を形質導入するために使用することができます。ウイルスタイターの詳細については、このプロトコルに含まれていませんが、で見つけることができます：

ANK "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8。

このプロトコルは、示された特定の製品を使用して最適化されています。他の試薬は置換されていてもよいが、同じ結果が保証されません。

プロトコル

1。 293TNパッケージングプラスミドを持つ細胞と発現コンストラクトのトランスフェクション

1. シード7.0から8.0×10 4 mM L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、抗生物質なしでウシ胎児血清（10％）を添加したDMEM培地を含む培養培地20mlで15 cm ^2の培養プレートあたり⁶ 293TN細胞。細胞密度は、トランスフェクション時の密集度60から80パーセントに達するように_2〜5％のCOと37℃で18〜24時間培養する。いくつかのケースでは、標的細胞の形質導入のための十分に高い抗体価を得るために細胞の種のいくつかのプレートに必要となる場合があります。
2. 細胞の各プレートについて、オートクレーブ2ミリリットルEppendorffチューブに1.6ミリリットルの無血清DMEMを追加します。上下にピペッティングしてDMEMとミックスに構築する45μlのごlentivectorのpPACKH1またはpPACKF1および4.5μgを追加します。
3. 同じチューブにPureFectionの55μlを添加します。 10秒間ボルテックスする。室温fでDMEM-プラスミドPureFection混合物をインキュベートまたは15分。
4. 組織培養プレートに均等にプレート全体に分散させる優しく滴と渦にDMEM-プラスミドPureFection混合物を追加します。インキュベーターに皿を返し、5％CO ₂で37℃で成長します。
5. トランスフェクション後にメディアを変更する必要はありません。あなたのlentivectorコンストラクトは、GFPのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現した場合、12〜24時間トランスフェクション後、顕微鏡下であなたの細胞を確認してください。あなたは、トランスフェクションが成功したことを示す、> 90％GFP陽性細胞を見ることができるはずです。
6. 50ミリリットル滅菌遠心管に細胞培養48時間後上清を72時間収集します。この細胞培養上清は現在、感染pseudoviral粒子を含んでいます。 （BSL-2の安全クラスを操作するための推奨ガイドラインに従ってください。）遠心1500×gで室温で15分間ペレット化し、細胞破片を。ペレットを乱さないように確保し、新しいチューブにウイルス上清を転送します。
7. ウイルスのパッケージングのために使用されている293TN細胞がバイオハザード容器に廃棄されるべきであり、ウイルスのパッケージングのさらなるラウンドのために使用されるようにされていません。

2。ウイルス上清の濃度

1. レンチウイルス粒子含有上清のすべての4ボリュームに寒い（4°C）PEG-それはウイルスの降水ソリューションの1ボリュームを追加します。大量のレンチウイルス粒子の沈殿は、コーニングを250mlのポリプロピレン製遠心チューブで達成することができます。反転チューブを数回して、ソリューションを混在させることなく、混合物ボルテックスしないでください。
2. （最大4日でも可）少なくとも12時間4℃で溶液を冷蔵してください。冷凍工程の間にチューブを振ったり回転させないでください。
3. 4℃で30分間1500×gで上清/ PEG-IT混合物を遠心分離℃に遠心分離後、レンチウイルス粒子がチューブの底にベージュや白のペレットとして表示されます。 supernataを注ぐNT。
4. ペレット中の沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないように注意しながら、吸引することにより、流体の痕跡をすべて削除します。の痕跡が残存PEG-それはウイルスを希釈します（したがって、力価を減少させる）が、PEG-それは不活性で毒性はないので、標的細胞の整合性に影響を与えません。
5. 再懸濁し、（4℃）寒い使用して、元のボリュームの1/100でレンチウイルス粒子を組み合わせて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはDMEM、25 mMのHEPES緩衝液を含む。
6. 使用直前まで滅菌低温バイアルおよび-70℃保存に分注し。

3。標的細胞のウイルスタイターと伝達

1. 我々は、標的細胞·オブ·関心を伝達し、実験間の一貫性を保つために、標的細胞に対して感染症の適切な多重度（MOI）を算出する前に、レンチウイルス粒子をタイ​​ターをお勧めします。ウイルスタイターのために、私たちは簡単に感染陽性対照ラインとしてHT1080細胞を使用することをお勧めします。 PLタイターのプロトコルを使用すると、パッケージ化されたレンチウイルス粒子の小アリコートでHT1080細胞を形質関与していることに注意して容易になります。力価が知られると、標的細胞·オブ·関心は生産レンチウイルス粒子でも導入することができます。 ：お勧めタイタープロトコルはで見つけることができますhttp://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7。
2. 細胞培養培地で24ウェルプレートにウェル当たりプレート5万標的細胞·オブ·関心。細胞は通常、インチその指定された培養条件で細胞は一晩増殖培養したメディアを使用しています。細胞は伝達の日にコンフルエント％70から50の間でなければなりません。
3. 伝達の日に、細胞から培地を吸引除去する。 1×の最終濃度（例えば、培養液500μlに2.5μlのTransDux）にTransDuxで培地を組み合わせたものです。その後TransDux-CEを転送各ウェルにLL培地の混合物。
4. 各ウェルに標的細胞に対するMOI最適に対応するウイルスの適切な量をピペットで。最適なMOIが不明な場合、我々は異なるMOIでの範囲（例えば、MOI 1、2および5の組織培養細胞を簡単に感染、およびMOI多くの困難には1、10および20のように試すことをお勧め）初代細胞を感染させる。レンチウイルス粒子の濃度が（としてのウイルスタイタープロトコルを介して決定される）が知られていない場合は、ウイルスの別のボリュームはそのようなウイルスの1、2、5μlのように、試すことができます。ウイルスは72時間までのターゲット細胞と接触したままにすることができます。
5. ウイルスの構造が宿主細胞のゲノムに組み込まれた後に導入標的細胞·オブ·関心を持ってさらなる実験は、72時間導入した後に開始することができる。特定のニーズに応じて標的細胞·オブ·関心媒体と通路を変更します。

4。代表的な結果

293TN細胞の出発密度が成功したウイルスのパッケージングのために重要です。 293TN細胞はトランスフェクション（ 図2）の日コンフルエント-80 60％の間でなければなりません。 293TN細胞が60％コンフルエント未満である場合は、それらのトランスフェクションを実行する前に、数時間のために成長することができます。 293TN細胞が> 80％コンフルエントある場合は、トランスフェクションの前に再播種する必要があります。

lentivector表現するGFPを使用する場合は、293TN細胞の少なくとも90％が成功したトランスフェクション（ 図3）を示す、トランスフェクション後緑24時間蛍光を発するべきである。細胞の90％未満ではGFP陽性であるときは、このトランスフェクションが成功しなかったことを示し、ウイルス力価が低くなるため、次のステップに進みません。代わりに、新しいプレート293TN細胞と293TN細胞はトランスフェクション前に、適切な細胞密度であることを確認して、やり直してください。

293TN細胞は48〜72時間トランスフェクション後の組織培養プレートをやってのけることができます。これは負のレンチウイルス粒子の産生に影響を与えません。

HT1080細胞でタイター

ウイルス力価は、製造元の指示に従って、SBIのグローバル超高速タイターキットを使用して計算することができます。このシステムは、HT1080細胞にレンチウイルスベクターからWPRE配列のウイルスの統合を測定する定量PCRを利用し、正確にmlあたりの感染ユニット（図4）を測定するためのゲノム基準配列に基づいて、標準曲線を比較します。

標的細胞の伝達

構成的に活性のGFPマーカーを発現するレンチウイルス粒子を使用している場合は伝達反応が動作している場合は、GFP陽性細胞は、形質導入の12から24時間以内に表示されるように開始する必要があります。レンチウイルスコンストラクトが安定トンに統合された後、GFPの発現は継続すべきである彼は細胞のゲノムをホストします。異なるMOIでで伝達する場合、低MOIでは、以下のGFPの蛍光を示し、高いMOIでは増加したGFPの蛍光を（ 図5）を示す場合には、GFPの蛍光は、約、MOIと一致する必要があります。

図1ウイルスの生産プロトコルの概要。 lentivectorとPPACKパッケージングプラスミドを混合し、293TN細胞に同時トランスフェクトされています。 48 -72時間後、ウイル​​ス上清を回収し、ウイルス粒子は、PEG-それを沈殿させる。レンチウイルス粒子をタイター後、彼らは標的細胞·オブ·関心を伝達するために使用することができます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

293TN細胞の図2の位相コントラスト画像。セルdensityは60〜80％コンフルエントにトランスフェクションの日の間でなければなりません。

図3 24時間Purefection、pPACKH1、とlentivector構築するエンコーディングGFPのトランスフェクション後のGFP陽性293TN細胞の蛍光画像。

図4。WPREの定量PCRの結果とMOIおよびパッケージのウイルス粒子の対応する力価を計算するためにSBIのグローバル超高速タイターキットを用いて得られた標準曲線。

HT1080細胞の図5蛍光画像は、レンチウイルスの量が増加して導入した。画像は72時間後の形質からです。

ディスカッション

このウイルスのパッケージングと標的細胞のプロトコルの伝達は、SBIのウイルスのパッケージング試薬の使用に最適化されています。他の試薬の置換は、プロトコルの結果に影響を及ぼす可能性があります。このプロトコルは、レンチウイルス生産用に最適化されており、ウイルスやpseudoviruses他の種類の製造に適しないかもしれません。

成功したウイルスのパッケージングは​​、いくつかの重要なステップに依存しています。 293TN細胞は、細胞培養上清中にレンチウイルス粒子の分泌のために絶対に必要であるSV40ラージT抗原を発現する。 293TN細胞はトランスフェクション時のもので、その密度が十分に細胞にlentivectorとパッケージングプラスミドを転送するPureFection試薬ためには特に重要です。徹底的にプレートを渦巻く続いて滴下方法で組織培養プレートにPureFection混合物を追加すると、パッケージングプラスミドの分散のために重要であるとlentivectorは、細胞のすべてにわたって構築します。適切にベクトルを配布するための障害は、生産されて不十分なレンチウイルス粒子になることがあります。ウイルスのパッケージング反応が組織培養プレートの表面積に基づいて、高力価のウイルスの生産のためにスケールアップすることができます。一つは、パッケージ化する必要がありますコンストラクト当たり293TN細胞のプレート、いくつかの組織培養皿に選択することができます。ウイルス上清の濃度が高力価のウイルスを作成する上で特に便利です。細胞の複数のプレートからウイルス上清は 、in vivo実験で 、または形質導入することは困難である細胞の使用のために組み合わせて、濃縮することができる。

生産レンチウイルス粒子をタイ​​ターは、標的細胞の形質導入に使用する正確なMOIを計算するために重要である。与えられた伝達に使用されたMOIを知ることは情報伝達が成功しない場合にトラブルシューティングが可能になります。たとえば、MOI、つまりを使用してが低すぎるコンストラクト·オブ·関心を非常に少数の標的細胞になることがあります。 MOIが高すぎるそれを使用して、しかし、ストレスの兆候を示す標的細胞になることがあります。目標は、MOI細胞の健康を維持しながら、コンストラクト·オブ·関心の表現を最大限にそれを使用することです。我々はHT1080細胞内でレンチウイルスコンストラクトの統合されたコピーを測定する定量PCRベースのタイタープロトコルをお勧めしますが、他のタイターのアプローチはまた、p24をELISAまたはGFP-陽性細胞の割合の推定として、使用することができます。

標的細胞の正常な伝達には、いくつかの重要な要因に依存しています。 TransDuxは、高い伝達効率を可能にするユニークな感染試薬であるが、それは細胞に毒性はありません。 TransDuxは、多くの場合、標的細胞への毒性があるポリブレンの代わりに使用することができます。標的細胞の形質導入におけるTransDuxの包含は、ウイルス粒子上の電荷を中和するのに役立ち、細胞内にウイルスを許可するだ。 TransDuxは細胞に有毒ではないので、1は、このように確率を増加させる、レンチウイルス粒子は最大72時間の細胞（ウイルスのコンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれていた時刻）と接触したままできるようにすることができますウイルス粒子は細胞を入力します。いくつかの困難な形質導入細胞については、形質導入は、導入効率を高めるために連続した日に繰り返すことができます。たとえば、1日目の細胞に形質導入​​、細胞は2日目に休息することができますし、3日目に再び細胞を形質導入する。標的細胞の選択、さらに実験や特性評価を開始する前に、最後の伝達後72時間を待つことが重要である。

効率的なウイルスのパッケージングは​​、5 'および3'LTR領域との間でも、レンチウイルスコンストラクトのサイズに依存しています。レンチウイルスコンストラクトのこのセクションでは、ネイティブのHIVゲノムのサイズに相当する、約9キロバイト以下にする必要があります。 9キロバイト月ドを超えて生産pseudoviral粒子のしわ価。新技術は、このようなpiggyBacトランスポゾンベクターとしては、最大1回のトランスフェクションを介して100キロバイトへの導入遺伝子の信頼性の高い、安定した統合を可能にします。このアプローチは、それが標的細胞をトランスフェクトすることが可能となり、ウイルスのパッケージング工程^9,10を必要と^しない付加的な利点を提供する場合にはレンチウイルスベクターのサイズ制限を超えて構造体に使用することができます。

このプロトコルを使用して製造pseudoviral粒子は、それらはほとんどの哺乳動物の細胞型を感染させることができるという点で感染性である。このプロトコルで使用される製品は、しかし、彼らは非複製と自己不活性化pseudovirusesを生成するという点で、第三世代のbiosafeです。したがって、一度標的細胞または動物に導入、標的細胞または動物が伝染性ではありません。バイオからお勧めできませんが、第三世代のbiosafeではありません他のlentivectorプラスミドの置換が可能です。視点。標的細胞のウイルス産生のプロトコルと、後続の伝達は、NIHのガイドライン¹¹に従って、バイオセーフティレベル2の下で実施されるべきであり、ウイルス粒子を取り扱う際には研究者は常に白衣や手袋を着用しなければならない。使用293TNプロデューサー細胞は、ウイルス粒子のチューブと使い捨てピペットは、適切なバイオハザード容器に廃棄する必要があります。再利用可能なピペットとガラス製品は、漂白剤で除染と人員の暴露を減らすためにオートクレーブする必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM高グルコース培地	ギブコ	11995-073
293TN細胞	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	HIVベースlentivectorsのために
pPACKF1	SBI	LV100A-1	FIVベースlentivectorsのために
任意のレンチウイルスベクター	SBI	さまざまな	cDNAを、shRNAを、マイクロRNA、転写レポーター
PureFection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-IT	SBI	LV810A-1 LV825A-1
グローバル超高速タイターキット	SBI	LV961A-1	このプロトコルに説明するが、ウイルス粒子を力価には必要ありません
TransDux	SBI	LV850A-1