オープンリーディングフレーム1（ORF1）ORF2接合領域に特異的なプライマーとTaqManプローブを利用して子どもの便からノロウイルス分離株の検出および遺伝子型の識別のためのワンステップRT-PCRアッセイ、ノロウイルスゲノムの中で最も保存領域です。説明します。非商業的、費用対効果の高いRNA抽出法が詳述されている。
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この記事について
サマリー
要約
ノロウイルス（NoVs）はすべての年齢の人間の世界的な散発的な急性胃腸炎の集団発生の主要原因となっています。彼らは、ロタウイルスに似た公衆衛生上の影響を持つ子どもの入院の重要な原因となっています。 NoVsは偉大な遺伝的多様性のRNAウイルスであり、新しい株の連続的な外観があります。五genogroupsが認識され、GIとGIIを彼らの多くの遺伝子型とヒトへの感染のために最も重要なサブタイプである。しかし、これら2つの遺伝子型の診断は、診断と治療を遅らせることは、問題のままである。1、2、3
糞便検体からのRNA抽出のために最も一般的に使用されるメソッドは、QiagenからQIAmpウイルスRNA市販のキットです。このメソッドは、コントロールRNaseがそのバッファを、シリカゲルメンブレンの結合特性を組み合わせて、マイクロスピンの速度と一緒にカラムにRNAの最適な結合を提供しています。このメソッドは、簡単で高速かつ信頼性が高く、カーです。製造元から提供されている記述で詳述されているいくつかのステップでiedを。
ノロウイルスは、下痢の最も一般的な原因として、ロタウイルスに次ぐです。ノロウイルスの診断は、下痢の病因のすべての研究で同様の発生、または個々の下痢症で使用できる必要があります。現在ではしかし、ノロウイルスの診断は、診断の簡単な方法の欠如に起因するわずか数センターに限定されています。この遅延の診断と治療1、2、3。さらに、国内および間に腐食性のバッファのコストと規制輸送に起因するこれらの製造キットの使用ロジスティック問題を引き起こします。結果として、このプロトコルで我々は、グアニジニウムチオシアネートの抗ヌクレアーゼのプロパティと一緒にシリカ粒子の核酸結合特性を使用して、元のブームらの方法4に基づいて、代替的、経済的、社内の方法を説明。
らによって記載されたプライマーを用いて5の主要タンパク質から高可変N末端 シェルをターゲットにして、従来のRT-PCRのために詳述されている。従来のPCRからのPCR産物のシークエンシングは、GIとGII genogroupsに属する遺伝子の分化を可能にします。
プロトコル
1。糞便サンプル
- 糞便サンプルは、RNAを維持するために凍結保存する必要があります。 10パーセント糞便懸濁液を作成するには、解凍糞便サンプルの約0.1グラムをとり、PBS 1 mlに完了します。
- 繰り返し凍結融解を避けるために、200μlのアリコート。 -70℃でアリコートを格納する
- 解凍および抽出に使用する前に、10分間4000グラムでアリコートを遠心分離します。
2。グアニジン＆シリカの抽出のためのシリカ粒子の調製
- RTで、二酸化珪素の30グラムを中断し、最大250 mLのdH 2 Oで完了します。
- 沈降の24時間後、吸引により上清215 mLを削除します。最大250 mLまでのdH 2 Oを追加し、振とうすることによりシリカペレットを中断します。
- 別の24時間後、吸引により上清を除去し、塩酸（HCl）を用いて、pHを2.0にシリカ懸濁液のpHを調整します。アリコートガラスのボットで得られたシリカ懸濁液tles、オートクレーブ。
3。グアニジン＆シリカの抽出のためのL6バッファーの調製
- 室温で、0.1 Mトリス塩酸50mLのpHは6.4と0.2 M EDTA、pH8.0の溶液を11 mLのグアニジニウムチオシアネート（....
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ディスカッション
糞便サンプルから核酸を単離するための経済的なインハウス方式を使用して、我々は、キアゲンから商用QIAmpウイルスRNAキットと同じように同じ結果を取得し、一緒に私たちの研究室で開発されたTaqMan RT-PCRで、私たちは月の広い範囲を検出することができますGIとGII遺伝子型に属する品種。領域Cプロトコルの最近の出版物は78％6のタイピング速度を報告した。現代のNOV株の多様性が前の年の間に増加しているので、成功率はテストされている標本の領域Cのプライマーのミスマッチに依存します。それがこうして時間7ターンアラウンドを短縮し、増幅後の製品の処理を排除するようにアッセイは、通常の診断に有用である。別に診断から、このプロトコルはまた、この疾患の公衆衛生上のコントロールに有用であるため、11月の感染症の疫学を明確にするために使用することができます。
スクリーニングを実行するときにRT-PCR、プライマー/プローブセット用のネガティブコントロール（NC）反応が閾値ラインを通過蛍光成長曲線を示すべきではありません。偽陽性は、プライマー/プローブ.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
著者らは、NOVのための標準と制御陽性の親切な贈り物を疾病管理予防のための国立カリシウイルス研究所センター（CDC）に感謝したいと試薬を提供するためのジョンズホプキンス大学公衆衛生学部の研究室です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| グアニジンイソチオシアネート | シグマAdrich | G9277 | |
| トリスHCl | Sigma-Aldrich社 | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich社 | E5134 | |
| シリカ | Sigma-Aldrich社 | S5631 | |
| トリトンX 100 | BDHケミカル | 14530 | |
| ジエチル | Sigma-Aldrich社 | D-5758 | |
| 別途準備ウイルスRNA Miniキット（250） | QIAGEN | 52906 | |
| 定量テックプローブRT-PCRキット（200） | QIAGEN | 204443 | |
| キアゲンワンステップRT-PCRキット（200） | QIAGEN | 210212 | |
| RNase阻害剤2000個 | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 UNIDが/バイアル |
| ノンスティックRnaeフリーマイクロチューブ | Ambionの | AM12450 | |
| 純アガロース1000年 | インビトロジェン | 16550-100 |
参考文献
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombin....
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再版と許可
