カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行う

Summary

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行うの簡単な手順が説明されています。手順は、ハイブリダイゼーションシグナルを定量化し、分析、マイクロアレイのスキャン、マイクロアレイにサンプルをハイブリダイズ、RNA、標識RNAとリファレンスのDNAを単離することがあります。

Abstract

マイクロRNA（miRNA）は、広く真核生物¹で表されている〜22ヌクレオチド（nt）長いRNA分子の大家族です。複雑なゲノムは主に転写後に標的遺伝子の膨大な数の^2、3の発現を阻害するmiRNAは、の少なくとも数百人をエンコードする。 miRNAは生物学的プロセス¹の広い範囲を制御します。さらに、変更されたmiRNAの発現は、癌などのヒトの疾患と関連している、とmiRNAは病気と予後^4、5のためのバイオマーカーとして機能することができる。それは多くの異なる条件下での発現とmiRNAの機能を理解することが重要です。

リアルタイムPCR、マイクロアレイ、およびディープシーケンシング：三つの主要なアプローチは、プロファイルのmiRNAの発現に用いられてきた。 miRNAのマイクロアレイの技術は、一般的に安価、高スループットという利点があり、実験と解析の手順のほとんどは、カーすることができますほとんどの大学、医学校および関連病院での分子生物学の実験室でIED。ここでは、カスタムのmiRNAマイクロアレイ実験を行う方法を説明します。 miRNAのプローブセットは、miRNAのマイクロアレイを製造するガラススライド上に印刷されます。 RNAは、小さなRNA種を保存する方法または試薬を用いて単離し、そしてその後、蛍光色素で標識されている。コントロールとして、miRNAのサブセットに対応する基準DNAオリゴヌクレオチドはまた、異なる蛍光色素で標識されています。リファレンスDNAは、スライドとハイブリダイゼーションの品質を実証するのに役立つだろうし、また、データの正規化のために使用されます。 RNAとDNAを混合し、データベースにおけるmiRNAのほとんどのプローブを含むマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせる。洗浄後、スライド、画像、および定量化の個々のスポットの強度を得るためにスキャンされます。これらの生信号をさらに処理し、対応するmiRNAの発現データとして解析されます。 Microarrayのスライドは、マイクロアレイのコストを削減し、マイクロアレイ実験の一貫性を高めるために除去し、再生成することができます。同じ原理と手順は、カスタムマイクロアレイ実験の他のタイプに適用可能である。

Protocol

1。カスタムmiRNAのマイクロアレイの印刷

1. マイクロアレイは、大学や企業ではマイクロアレイの中核施設のサービスを使用してスライド印刷。マイクロアレイ製造の品質は、マイクロアレイ実験の成功のための最も重要な要因の一つです。可能であればいくつかのサービスをお試しください。理想的には、一度に50から100までのスライドを印刷して、そしてすべてのスライドがうまく分離された、個々のスポットで、同一になります。
2. マイクロアレイのサポートについては、我々はGAPS IIコートスライドを使用してください。
3. miRNAのプローブでは、nCodeの複数種のマイクロアレイプローブがV2に設定miRNAを使用してください。
4. 10μMで、3 × SSC内のすべてのオリゴヌクレオチドを​​溶解し、四重にスライド上に印刷してください。 GAAPS IIスライドの指示に従って紫外線を照射して、スライドを固定。印刷されたプローブによるエリアとサイドをマークするためにダイヤモンドペンでスライドにラベルを付けます。 22℃で保存する

2。サンプルの準備

1. 任意のメソッドまたは試薬は、限り、それは、small RNAを保持するように、RNAを単離するために使用することができます。我々は一般的に_260nmのと_280nmの測定値が測定される、RNA調製物の十分な量と質で....

Discussion

深いシーケンシング技術の最近の進歩にもかかわらず、マイクロアレイは、DNAとRNAのハイスループット分析のための実行可能な選択肢です。ディープシーケンシングに比べて、マイクロアレイ実験には安上がりだし、典型的な分子生物学の研究室では、柔軟性を可能にすると時間の節約、社内での実験とデータ分析のほとんどを実行できます。将来的には、マイクロアレイの可能性は適して集中的に遺伝子のセットを調べるため、などですが、すべてまたはゲノムまたはmiRNAの中の転写因子のサブセット、およびここで紹介する同一の原理と手順を研究するためにカスタムマイクロアレイの実験で使用することができますmiRNAのほかに遺伝子ファミリー。もちろん、マイクロアレイについての主な欠点は、配列情報は、 先験的に利用可能でなければならないということです。どのように多くのmiRNA遺伝子が不明確のままされるがこれは、モデル生物の中で最もタンパク質遺伝子の家族のための問題ではありません。我々が使用されているプローブセットは、miRBase ⁸に基づいて設計されていますリリース9.0。最近の研究^{9、10.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アイテム	ベンダ	カタログ番号	コメント
マイクロアレイプローブセットV2をmiRNAの複数種をnCodeの	インビトロジェン	MIRMPS201	miRBaseリリース9.0（2006年10月）に基づいて設計されています。それは、〜1140変更されていない、ワーム、ハエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、及びヒトmiRNAのプローブとして、34〜44 ntの長いオリゴヌクレオチド、およびそのようなsnoRNAsのような内部統制のプローブの数が含まれています。 miRNAのプローブは、それ故に成熟miRNAに相補的な配列、〜44ヌクレオチドのサイズのダブレットです。分析のために一つは関心のある特定のゲノム（s）からのmiRNAに焦点を当てることができます。
トリゾール	インビトロジェン	15596018	トータルRNAサンプルは、このようなmRNAの解析のようなダウンストリームアプリケーションのための迅速かつ容易に準備すると、定量化し、適しているものの、我々はまた、標識のための豊かな、small RNA画分を使用している。
T4 RNAリガーゼ1	ニューイングランドBiolABS	M0204L
UlysisのAlexa Fluor ® 647核酸標識キット	インビトロジェン	U21660	このキットまたは類似の製品も同様に実験的なRNAサンプルやコントロールRNAを（代わりに、コントロールDNAの）ラベルを付けるために使用することができます。
5' - PCU - DY547 - 3'	Dharmacon	カスタムは行わ	small RNAの画分を同様に連結することにより標識することができる。
CentriSep列	プリンストンセパレーション	CS - 901
GAPSIIコートスライド	コー​​ニング	40004	スライドの他のタイプも使用されることがあります。
マイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバー	コー​​ニング	2551または40080	ハイブリダイゼーションチャンバーとカバースリップの他の種類も動作するはずです。市販のハイブリダイゼーションのマシンを使用すると、約2時間、、大幅に例えばハイブリダイゼーションの時間を短縮することができます。
Lifterslips	目ermo /エリー科学	25X60I - M5439 - 001 - LS
BlueFuse	BlueGenome
ジーンスプリング	アジレント