シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

Summary

シトクロムcオキシダーゼ/ナトリウム脱水素酵素（COX / SDH）二重標識法では、新鮮凍結組織切片におけるミトコンドリアの呼吸酵素の欠乏の直接可視化することができます。これは簡単な組織化学的手法であり、ミトコンドリア病、老化、および老化関連疾患を検討する上で有用です。

Abstract

ミトコンドリアDNA（mtDNA）の欠陥は、病気の重要な原因であり、変化の^1,2の高齢化や老化に関連する根底にある。老化のミトコンドリア説は、老化プロセス³で、生体エネルギーの恒常性と細胞機能を変化させることができるミトコンドリアDNA変異、の役割を示唆している。豊富な証拠は、この理論の^1,4、mtDNAの突然変異誘発マウス^5にする例のサポートでコンパイルされているが、高齢化のmtDNAの損傷の正確な役割は^、6,7完全には理解されていない。

呼吸酵素の活性を観察することによりミトコンドリアの機能障害を調査するための簡単​​なアプローチです。複雑なIV、またはシトクロム c オキシダーゼ （COX）は、ミトコンドリアの機能に不可欠です。 COXの触媒サブユニットはミトコンドリアDNAによってエンコードされ、複合体の構築（図1）のために必須であるされています。従って、適切な合成と機能は、主にミトコンドリアDNAの完全性²に基づいています。他の呼吸器複合体を調査することもできますが、複合体IVとIIは、組織化学的検査^8,9に最も適しています。増加はミトコンドリアの生合成^10-12を示すかもしれませんが、複雑なII、またはコハク酸脱水素酵素（SDH）は、完全に核DNA（図1）によってエンコードされ、その活性は、通常、障害のあるミトコンドリアDNAの影響を受けません。障害ミトコンドリア病で観察されるミトコンドリア、老化、そして加齢に伴う病気は、しばしば低いか不在のCOX活性^2,12-14と細胞の存在につながる。 COXおよびSDHの活動を個別に調査することができますが、連続した二重標識法^15,16は、ミトコンドリア機能障害^12,17-21で細胞を見つけるのに有利で ​​あることが証明されている。

アッセイの最適な憲法の多くは、基質濃度、電子受容体/供与体、中間の電子キャリア、pHの影響、及び反応のtとして、決定されているIME ^9,22,23。 3,3' -ジアミノベンジジン（DAB）は、効果的かつ信頼性の高い電子供与体²²です。機能COXを持つ細胞では、茶色のインダミンポリマー生成物は、ミトコンドリアのクリステに局在し、細胞^22を飽和します。機能不全にCOXとそれらの細胞は、青色ホルマザンの最終製品^9,24に、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、電子受容体の減少により、SDH活性の可視化を可能にする、DABの製品で飽和されることはありません。 シトクロム cとコハク酸ナトリウムの基板は、制御および変異型/疾患組織^{から9まで}の内因性レベルを標準化するために追加されます。カタラーゼペルオキシダーゼ活性^9,22から可能な限り汚染反応を避けるための予防措置として追加されます。フェナジンメトサルフェート（PMS）、中間電子伝達体は、最終の反応生成物^9,25の形成を高めるために、呼吸鎖阻害剤、アジ化ナトリウムと組み合わせて使用されます。これは、通知にもかかわらずationは、この上品な簡単なアッセイの結果に影響を及ぼすいくつかの重要な詳細は、特異性のコントロールやテクニックの進歩に加えて、まだ提示されていない。

Protocol

1。 cryosectioningのための組織の準備

1. 利用可能な倫理的な許可証に基づき、頸椎脱臼または断頭のいずれかの方法で動物を生け贄に捧げる。
2. 迅速に関心の組織（ 例えば 、脳）を収集し、迅速に（組織の最適な形態を得るために液体窒素で冷やしイソペンタンまたはプロパンで凍結が必要になる場合があります）ドライアイスで凍結。セクションに-80℃アルミホイルで店の組織は、° Cまでの準備。
3. cryosectioningの準備のために凍結組織を埋め込みます。
4. -21で14μmの凍結切片を収集° C（温度を調整する必要があります± 1〜2 ° C）。使用する準備ができるまで-20℃で封入することなく加熱ブロック、および店舗のスライドを使用してスライド上のセクションを解凍します。

2。 COXの組織化学

1. スライドは、1時間室温で乾燥することができます。湿った濾紙を持つスライド染色室でスライドを入れ、ストリップに切断。 consistenを取得するには各実験におけるtの結果、それは時間の遅延を最小限に抑えるため、実験ごとに10個のスライドの最大値を処理することをお勧めします。
2. 化学フード1X DAB、0.1 M PBSのpH = 7.0で100μM シトクロム cの下準備。すぐに渦。
3. （2μgのml

Discussion

複合COX / SDH組織化学的方法では、ミトコンドリア機能障害を有する細胞の可視化を可能にします。この手法は、初期の研究、1968年にさかのぼると、多くはそれの患者^14,19,26,27のミトコンドリア病を識別するための"ゴールドスタンダード"を考慮して、人気を保っています。それは今頻繁にmtDNA変異主導老化や老化関連疾患^{12,13,18,20,21,24を}調査するために使用されます。 COX / SDH二重標識法は、しばしば特定のミトコンドリアDNAの変異を同定し、さらにそのようなoximetric測定や分光光度酵素の解析^28,29のようなミトコンドリアの呼吸酵素を、調査する他の技術と並行して使用されています。

その長年の使用にもかかわらず、方法を改善するための重要な詳細、シンプルな特異性のコントロール、そして進歩はまだ発表されていない。組織の取扱いに関しては、このtechniqと新鮮凍結組織を使用することが重要です。UEは、COXはホルマリン固定後も存続しますが、ため、SDHはしません。こ.......

Materials

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
ドライアイス	AGAガスAB	ブロックの形
イソペンタン（2 - メチルブタン）	シグマアルドリッチ	277258 CAS：78-78-4
Cyrostat埋め込みソリューション	サクラファインテック	組織テック4583
クライオスタット	Microm	MicromモデルHM 500M
スライド	サーモサイエンティフィック	スーパーフロストプラス メンツェルグレイザー J1800AMWZ
カバーガラス ホウケイ酸ガラス	VWRインターナショナル	16004-098	24 × 50ミリメートル
ろ紙	テルフィルターAB	品質：1350 記事番号：242 001	430 × 430ミリメートル
3,3' - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）	シグマアルドリッチ	シグマ液体基質システム、D7304
シトクロム c（タイプIII、ウマ心臓から）	シグマアルドリッチ	C2506 CAS：9007-43-6
（肝臓から）カタラーゼ、ウシ	シグマアルドリッチ	C9322 CAS：9001-05-2
ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）	シグマアルドリッチ	N6876 CAS：298-83-9
コハク酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	S2378 CAS：6106-21-4
フェナジンメトサルフェート（PMS）	シグマアルドリッチ	P9625 CAS：299-11-6	PMSは、光に敏感です。光の盾。
アジ化ナトリウム	シグマアルドリッチ	S8032 CAS：26628-22-8
キシレン	VWRインターナショナル	EM - XX0060 - 4
Entellan	VWRインターナショナル	100503-870
マロン酸エステル （マロン酸）	シグマアルドリッチ	M1296 CAS：141-82-2