NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

サマリー

我々は、カナダ国立研究評議会で作製した平面パッチクランプチップは、滅菌プライミング、メディアをロードし、細胞を播種し、電気生理学的記録に使用される方法を示しています。

要約

その絶妙な感度とイオンチャネルレベルでの個々のセルを監視し、制御する能力のために、パッチクランプは同様の疾患モデルと製薬画面¹に印加される電気のゴールドスタンダードです。メソッドは、伝統的に静かにその頂点^2の下で膜のパッチを特定するために、生理的溶液で充填されたガラスピペットで細胞を接触させるが含まれます。ピペットに挿入された電極は、セル全体では、破裂膜パッチや、内のイオンチャネル活性をキャプチャします。過去10年間に、パッチクランプチップは別の^3、4として提案されている：サスペンドフィルムは、培養培地から生理的媒体を分離し、膜中に微細開口部は、ピペットの先端を置き換えます。パッチクランプチップは自動化されたシステムに統合し、ハイスループットスクリーニング⁵のために実用化されています。 INCRにスループットを容易に、彼らは、細胞にプローブシールを検出し、全細胞モードに入るための流体懸濁​​液からの細胞の配信、吸引開口部上でのポジショニング、および自動化されたルーチンが含まれています。我々は、培養されたカタツムリのニューロン⁶の活動電位の高品質な録音を可能にする最適化されたインピーダンスとオリフィス形状のシリコンパッチクランプチップの作製について報告している。最近、我々はまた、哺乳類のニューロン^7を尋問に向けた進捗状況を報告しています。私たちのパッチクランプチップは、カナダのフォトニクス製作センター^8、商業ファウンドリで試作し、大規模なシリーズで利用できます。我々は、異なるモデルでNRCC技術の使用を検証するためelectrophysiologistsとのコラボレーションに従事することを熱望している。チップは、図1で表される一般的な方式に従って使用されています。シリコンチップは、プレキシグラス培養バイアルの底にあり、開口部の背面は、地下channに接続されていますエルは、パッケージの両端にチューブを装着。これは、細胞内のガラスピペットに比べ優位である。細胞に最小限の障害と解決策の交換を促進する細胞は、バイアル中で培養されており、プローブの上にセルが流体の外部ポートをチャネル2に挿入された測定電極によって監視されている灌流。

図1。NRCCパッチクランプチップを用いた測定の原理

ここでは詳細に殺菌し、内閣総理チップを、細胞と培地、プレート、それらを使用してそれらをロードし、最後に電気生理学的記録のためにそれらを使用するプロトコルを設定します。

プロトコル

1。チップ製造

3μmの厚さの自立膜を、低1MΩでアクセス抵抗とセル⁹との親密なシールを容易に滑面漏斗状の開口部⁶の結果に記載されたプロセスは、図2を参照してください。チップは、地下のチャネルにチップを接続する穴が直面している開口部とプレキシグラスパッケージに個片化と接着されています。接着は、公称17 pFのシャント容量を最小限に抑える方法で分配される。パッケージは2つの1.5 mm径と流体ポートを6 mm長のガラス管（図3）が取り付けられています。

NRCCパッチクランプチップの集束イオンビームセクションの図2走査型電子顕微鏡写真は、滑らかな二酸化ケイ素表面と漏斗状の親密な細胞の接触を支持し、低アクセスresistancのアカウント浅いオリフィスを示しています。E。

図3チップは地下の流体とガラス管を装備しプレキシグラスパッケージで培養バイアルの底部に接着されています。

2。殺菌、プライミングとテスト

次の手順は、開口部の汚染や閉塞を避けるために、生物学の安全キャビネット内で実行する必要があります。

• 18 W.その他の空気プラズマシステムの最大電力で15分間0.1から0.3ミリバール残留空気の圧力でHarrick基本的なプラズマクリーナー（www.harrickplasma.com）にチップを滅菌匹敵する電力密度（24 mWので、使用することができ個/ cm ^3）と、電力密度と時間の積を一定に保ちます。プラズマ処理はまた、プライミングを容易にする、チップは親水性がレンダリングされます。
• 無菌のシラスティックラボラトリーシリコンチューブ、1ミリメートルID x 2mmのOD（コールパーマーとガラス管に適合猫。片側＃96115から08）、3インチ、反対側に1インチ。
• に気泡がトラップされていないことを確認し、滅菌濾過し、標準のリン酸緩衝液（PBS）とチューブを介して流体を記入してください。
• 1気圧の短辺からPBSを加圧しながら、長いシリコンチューブをクリップ。開口部を通って浸透PBSのプールは、バイアル中の目に見えるかもしれません。 PBSの加圧供給をクリップし、その電源から短いシリコンチューブを外します。
• シリンジを用いて濾過し、PBSでバイアルを記入してください。
• Clの短い管の電極とバイアル内の対向電極：銀/ Agを浸します。インピーダンスメーターはアクセス抵抗は300kohmと3Mohm間にあるとシャントキャパシタンスは10pFと25pFの間にあることを確認するために使用されています。低い抵抗を持ったチップはリークが発生する可能性があり、それは細胞の電気生理学⁶の最高速のダイナミクスを捉えることはできません、より高い静電容量は、使用のために不適切と見なされます。低静電容量を持つチップそれは単にバブルがオリフィスにトラップされているかもしれませんけれども以上の抵抗は、プラグインと見なされます。いくつかのチップは、1H後に再テストし、正しい電気化学インピーダンスを有することが明らかにされています。
• 滅菌脱イオン水と流体チャネルをフラッシュし、バイアルを空にして二回、同じで洗い流してください。
• 滅菌脱イオン水で満たされ、滅菌容器内に他のチップでロードして30分間新鮮な滅菌脱イオン水でチューブをパッケージ化チップを浸す。これは、チップは親水性と汚染から保護されたままであることを保証します。

3。細胞生物学研究室のチップの準備

次の手順は無菌技術を使用してHEPAフィルタ層流フードで実行され、この手順で使用されているすべてのソリューションは、0.22μmフィルターを用いて使用前に滅菌ろ過しなければなりません。

• HEPAフィルタ層流フードの下にチップコンテナを開き、コンタからチップを取り外す慣性力はトップバイアル中に可能な浮動小数点の汚染物質をすくい避けるためにダウンに直面しています。
• チップ表面からあらゆる残留破片を除去するために新たにろ過滅菌脱イオン水とチップの2倍のバイアルの上部を洗浄します。
• バイアルから滅菌脱イオン水を吸引除去する。
• 滅菌濾過し、脱イオン水を含む加圧注射器に流体チャネルに接続されてシラスティックチューブの一端を接続します。私たちのシステムでは、溶液を充填シリンジは20psiに設定され、圧縮空気タンクに接続することにより加圧されています。不稔性を確保するために、空気が注射器に入る前に（0.22μmのフィルター）と私たちのシステムは、必要なときに私たちは圧力を停止するか、または適用することができますオン/オフバルブを持っています。
• 止血剤を使用して、チューブの出力端をクランプします。
• ソリューションを加圧するためにバルブのオン/オフを開きます。
• 新鮮な滅菌脱イオン水とチップのsubterranen流体をすすぐために、チューブの出力端をクランプ。
• 用に開口部を介してCEが水の上、止血とチューブの出力端をクランプします。
• 排水を避けるために、hemostatsとチューブの入力および出力端部をクランプし、オン/オフバルブを閉じます。
• シリンジからチューブの入力端を外します。
• チューブの両端にガラスプラグを挿入し、hemostatsを削除します。
• フィルタsteriled脱イオン水でバイアルを記入してください。
• 100ミリメートル滅菌シャーレの底部に35ミリメートル滅菌シャーレの蓋を置きます
• 100 mmディッシュの蓋付きの35ミリ蓋、カバーの上に場所チップ。
• 画像チップは、チップの膜と絞り値で破片、および/ ​​または気泡の自由であることを確認してください。 私たちの研究室では、我々は正立顕微鏡と20倍の長作動距離対物レンズを使用しています 。
• 破片および/または気泡が存在する場合は、繰り返し流体チャネルとバイアルをフラッシュします。破片および/または気泡が除去できない場合はチップは破棄されます。
• チップはいったん撮像され、層流フードに戻り、チューブの両端を抜いてください。
• 生理的なメディアを含む加圧された注射器にチューブの一端を接続します。
• 止血剤とチューブの出力端をクランプ
• 圧力弁を開き、流体の出力端から止血剤を除去し、生理的なメディアとの流体チャネルをフラッシュ
• 生理的なメディアと地下流体をすすぐために、オン/オフバルブを開き、チューブの端から止血剤を削除します。
• 開口部を介して生理的なメディアを強制的に実行するには、止血とチューブの出力端をクランプします。
• 止血剤とチューブの入力端をクランプし、バルブのオン/オフして閉じます。
• GLASプラグの付いたチューブの両端に注射器とプラグからチューブの入力端を削除します。
• hemostatsを削除します。
• バイアルから水を除去する。
• フィルター滅菌生理メディアとのバイアルをご記入ください。
• 100ミリメートルのペトリ皿にチップの背面に配置します。
• 100 mmディッシュに35 mmのシャーレの底に置き、湿度を豊かにするフィルター滅菌脱イオン水でそれを記入してください。
• それはメッキのための時間になるまで料理をカバー

4。カタツムリのニューロンの細胞播種

パッチクランプチップは、準備の多様適している場合があります。我々は現在、哺乳類の一次皮質ニューロンと私たちのチップをテストして、我々の滅菌プロトコルが適切であることを示し、チップは、長期培養では細胞毒性ではないことを14日間^7日培養した細胞での予備的な結果を得ています。彼らは神経細胞の電気生理学^11を勉強するための単純ながらも確立されたモデルを表しており、それは我々が日^〜10最も重要な結果を得たことをこれらの細胞であるため、このプロトコルの目的のために、カタツムリのニューロンが選ばれました。詳細な細胞単離および培養の手順がある^13日以前に¹²に記載され。

• 鈍鉗子と10％のリステリンを含むLymnaea生理食塩水で麻酔動物を用いた2から3ヶ月のLymnaea stagnalisから外殻を削除します。

  室温で滅菌解剖機器やソリューションを層流フード内で無菌的に行われ、後続のすべての手順を実行します。

• エッペンドルフピペットを使用して、適切な録音ソリューションと流体の生理的媒体を交換してください。 Lymnaeaニューロンの場合の解決策が含まれています（mMで）：50のKCl、5のMgCl _2、5エチレン（oxyethylenenitrilo）四酢酸（EGTA）、5 4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンカルボン酸（HEPES、pH7.4の、130浸透圧^）14
• Lymnaea生理食塩水で満たされたSylgard皿にカタツムリを固定し、以前に^13を説明したように脳全体を削除する
• isolatを扱う15分間DMとトリプシンインヒビター（Sigma社、大豆、カタログ番号T-9003）の治療に続いて18分間トリプシン酵素（0.2％溶液、シグマ、カタログ番号T-9201）と定義されたメディアのedは脳（DM）。
• （ - ; 20 mLのDMに1Mグルコース溶液750μlのグルコースが追加されたDM HODM）メディアを定義して高浸透圧で満たされた小さなSylgard皿に脳をピン。
• 微細な鉗子と解剖はさみを使用して、神経を露出し、興味のある神経の外側と内側のシースを除去します。
• ニューロンは脳から切り離されて、ピペットで懸濁しされるまで、火研磨したガラスピペットHODMを充填し、マイクロシリンジに接続されているを使用して、目的の細胞（左ペダル背1）に近い穏やかな吸引を適用します。
• ガラスピペットは、その後移動し、マイクロシリンジからの穏やかな追放は、ニューロンが静かにピペットから押し出さとチップ上の個々のパッチの穴の上に配置することができ、個々のneurochips中に浸漬されています。
• 細胞は、開口部を囲むチップ表面への付着を促進するために、室温で2時間の最小邪魔されずに座ることができます。

5。電気生理学的記録

アンプにチップを接続するには（この例ではMulticlamp 700Bアンプ、分子デバイス、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国 ）

• 地下の流体で、適切な録音ソリューションでチップバイアル内の溶液を交換してください。 Lymnaeaニューロンの場合には、上部の文化室はLymnaea生理食塩水（mMで：51.3のNaCl、1.7 KClを、4塩化カルシウム、および1.5のMgCl 2）が充填されHEPESでpHを7.9にバッファリング^14。
• 安定性のために、接着剤をガラススライド上にチップと顕微鏡下に置きます。
• アンプ（この例ではMulticlamp 700Bアンプ、分子デバイス、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国 ）にチップを接続するには、チューブの一方の端をカットし、シルヴァを挿入ヘッドステージに接続されているrは線。
• チップのバイアルに参照電極を配置します。
• チップは現在レコーディングの準備ができています。
• 、全細胞（RT =示すMΩ50から100に加えて、容量過渡応答、（R _T> 1GΩ）のセルに接続された：総抵抗（R _t）を測定し、神経細胞の構成を決定するためのアンプと5 mVステップを適用します。の開口部上に膜破裂）、またはしないシール（R _トン MΩ<5）。実験¹⁰の最後のセットでは、細胞の58％％が高抵抗のシールを持っていて、それらの細胞の80％が興奮性反応を示した。

6。代表的な結果

• ニューロン（この場合LPeD1で）に電流パルスを（20 pAの増分）脱分極が適用されます。
• その静止電位へのVMのclose（ - 60 mVの〜）でニューロンを保持します。
• これらの脱分極パルスに対する応答を観察します。シュート活動電位べきニューロンが利用可能である場合は観察することができます。
• 図4は^、14、15に詳細に説明されて代表的な結果を示しています。

細胞内の電流パルス（下記参照）の段階的な一連のLPeD1ニューロンの図4の電圧応答（上）。 60mVの - 電流パルスは、VM =で適用された。

トラブルシューティング

• メッキの前に、細胞膜と絞りが破片の自由とメッキに適しているかどうかを判断するための画像チップ。我々は、正立顕微鏡と20倍の長作動距離対物レンズを使用しています。実験¹の最後のセットでは、チップの67％％が正常にその方法でプライミングされた。
• 破片および/または気泡が存在する場合はチップを破棄して別のを試してみてください。
• 各種表面処理（プラズマ）やコーティングは（PDL、PEIなど）が試みられるかもしれませんが、成功は細胞の種類に大きく依存しているかもしれません使用されます。
• ギガシールと全細胞の形成に重要なの流体（ "ピペット"）溶液の組成。浸透圧、pH、およびイオン化粧品に注意を払って、解決策を調整します。
• 長期培養のために、穏やかな重力を与え血流（〜0.5 ml /分）を経由して録音する前にソリューションをピペットに切り替えて、マイクロチャネル内のメディアで始まります。

ディスカッション

NRCCのパッチクランプチップの尋問プラットフォームは、高い情報内容医薬品アッセイのための潜在的に強力なツールであり、疾患の in vitroモデルで調査する。ガラスピペットと比較して、その利点は、大規模な細胞を調べるための利点である低アクセス抵抗であり、やや大きめの容量にもかかわらず、小さなセルに匹敵する動力になります。開口部シールの自発的なセルは、日常的に得られており、全体のセルのエントリは、自発的な¹⁴であることが観察されています。チップとガラスピペット法の間に明確な違いは、プローブは、細胞培養皿の一部であり、手動で細胞膜に接触されていないという事実である。細胞を培養、機能ネットワーク、疾患モデルとして多くの生物学的に関連したモデルの結果、シール^16を調べるために、高い細胞を保護するための異なるメカニズムの可能性がある部分。しかし、細胞懸濁液と対照的に、吸引cannotはプローブ上のセルを配置するために使用することができます。カタツムリのニューロンは、他の大規模な細胞として、プローブの上に手動位置決めに適している。より長い培養時間を必要とする小さな細胞については、我々は上のセルの配置を任意の操作が不要にし、プローブの上にセルを配置するためのプローブの上にパターニング接着ペプチドによるシールを得るための高い確率を保持し、実証したプローブ^17,18。

NRCCは、ガラスピペットと同等の容量を持つマイクロパッチクランプチップ^19をポリイミド開発しています。そのプロジェクトの究極の目標は、個々のイオンチャネル¹⁴の解像度で、ネットワークの動作に従事し、いくつかのニューロンの電気生理学的活性の同時モニタリングを可能にする複数のプローブパッチクランプチップです。このメソッドは、マルチ電極アレイ20に高解像度補完的な方法です。