植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

Summary

市販その場でハイブリダイゼーションプロトコールは、高感度と特異性を持つ細胞レベルでのmRNAと小さなRNAの発現の直接局在することができます。手順はパラフィン包埋植物の組織切片用に最適化され、植物や組織の広い範囲に適用可能である、と10日以内に完了することができます。

Abstract

過去十年間のゲノム研究の進歩に伴い、植物の生物学は、遺伝子発現の大規模な定量的な分析を提示する多くの研究を見ている。マイクロアレイや次世代シーケンシングのアプローチは、発達、生理、ストレス応答のプロセスを調査エピジェネティクスとsmall RNAの経路を分析、及び^1-3大規模な遺伝子調節ネットワークを構築するために使用されている。これらの技術は大規模な遺伝子セットの同時分析を容易にする一方で、彼らは一般的に遺伝子発現の変化の非常に限られた時空間解像度を提供しています。この制限は、部分的に^4-7をソートlasermicrodissectionまたは蛍光活性化細胞と一緒にどちらかのプロファイリングメソッドを使用して克服することができます。しかし、完全に遺伝子の生物学的役割を理解するために、細胞の解像度での表現のその時空間パターンの知識が不可欠です。特に、開発や環境へのSTIの影響を研究するときmuliと変異体は、遺伝子の発現パターンの詳細な分析が不可欠になることができます。特定の細胞型における発現の損失または利得に関連付けられているときに例えば、キー調節遺伝子の発現レベルの微妙な量的な違いは、劇的な表現型につながることができます。

いくつかの方法は、日常的に遺伝子発現パターンの詳細な検査のために使用されています。一つは、トランスジェニックレポーターラインの分析を通じてです。このような分析は、しかし、複数の遺伝子を解析または変換に負えない所で作業する際に時間がかかるになることができます。また、導入遺伝子の発現パターンは内因性遺伝子のことを模倣することを保証するための独立した検証は、通常は必要です。 in situハイブリダイゼーション免疫組織化学的蛋白質の局在またはmRNAは、細胞や組織内の遺伝子発現の直接可視化するための比較的高速な代替案を提示。後者は、それが容易にuをすることができる明確な利点を持っています興味のある任意の遺伝子上のsed。situハイブリダイゼーションでは、目的の遺伝子のin vitro転写により得られたプローブを標識したアンチセンスRNAとのハイブリッド形成による細胞内で標的mRNAの検出を可能にする。

ここでは、非常に感度と特異的であり、植物における遺伝子発現の in situ局在のためのプロトコルの概要を示します。それは、パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋切片、組織学の優れた保全を与え、そして免疫検出し、アルカリフォスファターゼ比色反応により可視化DIGラベルされたプローブでの使用に最適化されています。このプロトコルは、正常な植物種の広い範囲から採取した組織の数に適用されている、とmRNAと同様の低分子RNA ^8月14日の表現を分析するために使用することができます。

Protocol

1。サンプルの準備

注：最大とハイブリダイゼーション工程を含む、すべてのステップは、RNase活性に敏感です。したがって、クリーンな条件下で動作することが不可欠である。それは、少なくとも3時間、180℃で焼成DEPC処理水とガラス製品を使用してすべてのソリューションをRNaseフリーにすることも非常に一般的です。プラスチック容器は、多くの場合、30分間、0.2N NaOHで処理してクリーンアップされます。しかし、これらの予防措置はいずれも不可欠ではありませんし、我々は通常、すべてのソリューションのために定期的なクリーンミリQ H ₂ Oを使用してください。我々は、 サイチュハイブリダイゼーションのために別々の試薬 ​​、ボックスやガラス製品を維持し、清潔なキャビネットに、これらを保存しません。

1. サンプルの固定
   1. 1日目：新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）固定液を準備する。 500ミリリットルのため、60〜400ミリリットルの1X PBS（130 mMのNaCl、7 mMののNa ₂ HPO _4、3mMののNaH ₂ PO ₄ pH7.0）暖かい° CとNaOHの二つペレットを溶かす。ドラフトでは、paraformaldehy 20gを追加ドし、溶解するまでよく混ぜる。氷の上にソリューションを配置し、H ₂ SO _4（100ミリリットル用1〜2滴）を7.2にpHを調整し、冷却するとき。その後、1 × PBSで500mLに音量を調整します。
      注：これは非常に有毒なフュームを放出するようにpHを調整するために塩酸を使用しないでください。パラホルムアルデヒドは有毒であり、このソリューションは、したがって、ドラフト内で調製し、そして適切に処分する必要がある。また、パラホルムアルデヒドで4℃で保存され、新しいは6購入する必要がある - 9ヶ月。
   2. 収穫の組織サンプルやガラス製シンチレーションバイアルに氷上で15 mLの新鮮なPFAの固定液で即座にそれらを置きます。組織の切開が必要な場合、これは最高の冷固定液に氷の上で行われます。
      注：固定剤の大過剰を使用することが重要である。一般的な推奨比率は、組織の1ボリュームへの固定液の10倍量を使用することです。
   3. 氷上しながら試料に真空を（〜500ミリメートルHg）適用されます。 15〜20分間真空を保持し、小さな気泡は、サンプルから解放する必要がありますのが固定剤は、沸騰に来てください。徐々に真空を解放し、固定液は、右の濃度で保持することは、PFAの固定液を更新。組織は真空のリリース後に沈むまで、この手順を繰り返します。
      注：固定が組織内のRNA分子を固定して架橋するために必要とされる。不十分な固定材料は低信号を得るため、この手順は重要です。いくつかの組織がすぐにシンクしていないが、ほとんどは最終的に一晩シンクします。固定液の浸透を向上させるために、以下の界面活性剤を添加することができる：トリトンの0.1％増と/または0.1にまでトゥイーンする - 0.3％。このようなホルムアルデヒドアルコール酸性酸（FAA） ​​などの別の方法として、エタノールベースの固定液は、、そうでなければ簡単に^14,15に侵入されていない組織のために使用することができます。
   4. もう一度PFAの固定液を交換して、4℃で一晩バイアルを保持。
2. 組織の埋め込み
   1. 2日目：4のプレクール1X PBSおよびエタノール系列℃に
   2. サンプルTWIをすすぐ氷上で30分間1 × PBSでそれぞれ、のCE。
      注：ここでも、それがそれぞれのソリューションの大過剰を使用することをお勧めします。
   3. 以下のように、氷上で、エタノールのシリーズを介してそれらを取ることによって試料を脱水する。
      • 10％エタノール30分、
      • 30％エタノール30分、
      • 50％エタノール1時間、
      • 70％エタノール1時間、
      • 85％エタノール1時間、
      • 95％エタノールで1時間、
      • 1時間ごとに100％エタノール3変化
   4. 一日の終わりには、4℃で一晩100％エタノールに0.1％エオシンによってエタノールに置き換える℃にエオシン染色は細胞壁には埋め込みとセクショニング時にサンプルがより見えるように。
      注：時間はここに示された3x3x3 mmのブロック用に最適化されているが、長いインキュベーションが大きなサンプルが必要となる場合があります。
      サンプルは、数ヶ月間、4℃で70％エタノールに保存することができます。 3日目：次の朝、1時間室温にサンプルを暖める。その後、次のようにhistoclearで徐々にエタノールを置き換えます。
      
   5. 一日の終わりには、Paraplastプラスチップの1 / 4量を追加し、60℃のオーブンでバイアルを置きます。またParaplastチップでビーカーを記入し、常に手元に新鮮な溶融ワックスを持つために頻繁にこれを補充する。
      注意：オーブンの温度が60上記Paraplastの重要かつ長時間加熱である° Cは避けるべきです。
   6. 4日目：徐々に定期的に多くのパラフィンチップ（毎時）を追加することによってParaplastでhistoclearに置き換える。一日の終わりには、慎重にhistoclear /ワックス混合物を取り除き、すぐに、純粋な溶融ワックスに置き換えてください。 ℃で一晩60℃のサンプルにしておきます。
   7. 日5および6：sを保ち、新鮮な溶融ワックスで、4時間ごとに約、毎日Paraplast 3回の変更60 amples℃の
      注：これは、1日に1回だけワックスを変更することは可能ですが、ワックスは、少なくとも5〜6回を変更する必要があるとして、組織の準備が、完了するためにいくつかの追加日かかるだろう。これらは100％エタノールおよび/またはワックスにしている組織サンプルの減圧浸潤は、さらに組織の浸潤や埋め込みを向上させることができます。ワックスのサンプルの減圧浸潤は60℃で行われる必要があります
   8. 7日目：もう一度ワックスを変更します。 histoclearの臭いが完全になくなっているはずとサンプルは、その日の後に埋め込むことができます。
   9. 60℃大温暖化プレートを設定するアルミホイルで保護されているC。
   10. 埋め込みの方法は、分析される組織の種類によって異なります。このステップで最も重要な点は、サンプルは後で切片のために正しい向きであることを確認することです。一つの方法は、プラスチック金型とリングを使用することです。温暖化プレート上に金型をウォームアップし、金型の底部に溶融ワックスを注ぐ。転送温められた鉗子と向き、それ目的の位置にある金型に組織サンプル。金型の上に白のリングを置き、組織が完全に覆われるような追加の溶融ワックスを追加します。慎重にベンチにプレートから金型を移動する。ワックスが徐々に冷却させます。

別の可能性は60℃に加温したプレート上での作業中に溶けたワックスを（サンプルは完全にワックスでカバーされるべきである）を含むペトリ皿内のすべてのサンプルを配布することです。暖かいピンセットで試料をオリエンテーション。最後に、プレートのスイッチをオフに。ワックスが固化されると、ペトリ皿は、ベンチに移動し、4℃で保存することができます℃までときに切片の準備ができて、組織サンプルを含む微小なブロックを暖めたブレードでペトリ皿から切り出し、溶融ワックスの余分な電圧低下でミクロトームを試料ホルダーにマウントすることができます。セクショニングの前に数分間のサンプル硬化をしましょう​​。

注：可能なブロック4℃で保存すること℃で1年以上。組織固定と埋め込みの追加の役立つヒントについては、refを参照してください。 16

2。プローブの準備

1. クローニング
   プローブは通常、目的の遺伝子の1つ以上の特定の領域に生成されます。高度に反復配列がプローブ対象から除外する必要がありますが、そのような転写因子のDNA結合モチーフとして保存されたタンパク質のドメイン、、に対応する配列は、通常、遺伝子特異的発現パターンを^8,9,12,15（図1）が得られます。これがため、ポストハイブリダイゼーションのステップでRNase A処理は、（下記参照）遺伝子ファミリーのメンバー間のプローブのクロスハイブリダイゼーションのレベルを減らします。 RNA二重鎖のミスマッチでRNアーゼは切断し、以降の手順でオフに洗浄される不完全な相補性を持つ転写産物にハイブリダイズする断片化プローブ。
   一般的には、いくつかのプローブは、関心の各遺伝子のためにテストする必要があるかもしれません。プローブの長さは150塩基限り短くすることができます。 AlthougHプローブの長さに制限がない、1.5キロバイトが一般的に良く転写して短いDNA断片。転写されるDNA断片は、T3、T7、またはSP6プロモーター（例えばpCRII - TOPO、Invitrogen）を含むベクターにクローン化されています。また、T3、T7またはSP6プロモーター配列は、プローブの領域を増幅するために使用される逆方向プライマーに5' -尾部として含めることができます。
   in situハイブリダイゼーション実験のすべてにおいて、我々は、ハイブリダイゼーションパターンが既知となるが、一貫して動作されているポジティブコントロールプローブだけでなく、ネガティブコントロール（図1DおよびH）が含まれています。後者は、関心のある組織内のすべての転写産物にハイブリダイズしないことを知られているランダムなRNAプローブである可能性があります。それは解析対象遺伝子のセンスプローブを使用するのが一般的ですが、これは必ずしも必要ではなく、任意の非ハイブリダイズRNAは、目的に合うでしょう。利用可能な場合は、目的の遺伝子の転写ヌル対立遺伝子からの組織は、優れたネガティブコントロールとして役立つであろう。
   
2. in vitro転写
   1. プロモーターの部位の反対側インサートの終わりに消化する制限酵素で約5μgのDNAを消化してプラスミドを線形化する。 3' -オーバーハングを残す制限酵素を使用しないでください。ポリメラーゼが転写を続けるために、基質として3'オーバーハングを利用することができるので、これは転写の成果物につながることができます。また、T3、T7またはSP6プロモーターを含むプローブ領域は、in vitroでの転写反応のためにDNAのテンプレートを生成するためにPCRにより増幅することができる。
   2. 反応が完了する行っていることを確認するためにゲル上にアリコートを確認してください。
   3. 、フェノール/クロロホルムでDNAを抽出し、エタノールで沈殿し、1μg/μlの濃度にミリQ H ₂ OでDNAペレットを再懸濁します。また、DNAは標準的なDNA精製カラムを用いて洗浄することができます。
   4. 混合することによりin vitro転写反応で設定します。
      • 1μlのPUrified DNA（1μg/μl）
      • 2μlの10 ×転写バッファー
      • 2μL10xのDIG RNAラベリングミックス
      • 1μlのRNアーゼOUT
      • 2μlのT3、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ（20 U /μL）
      • 20μlのへのH ₂ Oまで。
      
      37℃で1〜2時間。後でゲルで分析することが1μlの保管してください。
      注：蛍光標識プローブは動物系に好ましいこともありましたが、植物のためのin situハイブリダイゼーションのプロトコールでは 、ほとんどの植物組織の自家蛍光が高いため、より一般的に放射性標識プローブ¹⁷または免疫組織化学によって検出されるDIGラベルされたプローブを使用している。
   5. 転写反応を75μLミリQ H ₂ Oおよび5μLRQ1 DNアーゼ（1 U /μl）を加えると37反応℃で10分間インキュベートすることによりDNAのテンプレートを削除します。
   6. 非法人のヌクレオチドとの短い転写産物を除去するためのin vitro転写反応で浄化する。 One possibilityは、このようなミニクイックスピンRNAカラム（Roche社）と、サイズ排除セファデックス®の列を使用することです。また、転写反応は、従来の塩化リチウム/エタノール沈殿（refを参照。14）で精製することができる。後ゲルをチェックするために1μlの保管してください。
   7. 長さが250塩基以上のプローブは、通常、部分的に約150 NT、したがって、効率的に組織切片を貫通して十分に小さいのRNA分子を得るために加水分解されています。 60精製された転写反応とインキュベートして2倍の炭酸緩衝液（80mMのNaHCO _3を 、120mMのNa ₂ CO _3）を等量の℃にインキュベーション時間は以下の式で計算する必要があります。
      時間=（リチウム - LF）/（K XのLi x LF）
      ここで、リチウム=初期プローブの長さ（KB単位）、LF =最後のプローブの長さ（0.150キロバイト）、K = 0.11キロバイト/分。ゲルをチェックするために2μLをしてください。
   8. 10％酢酸の1 / 20量を添加することにより加水分解反応を中和する。
   9. プローブは、プリです。1 / 10量の3M NAAC液（pH5.2）に加えて、2.5倍量冷100％エタノールのtRNA（100mg/ml）、1μlを添加し、30分間-80℃でインキュベートすることによって検証してください。 4℃、20分間13500回転℃で遠心してRNAを沈殿させる上清を捨て、500μL、70％エタノールでRNAペレットをリンス。心する、ペレットを空気乾燥して（通常は約15分）せて、そして50μlの50パーセント脱イオンホルムアミドでRNAを再懸濁します。プローブは、-80℃で使用時まで保存してください。
   10. セクション2.2.4、2.2.6および2.2.7（図2A）から標準の1％TAE -アガロースゲル最終製品だけでなく、中間製品を確認してください。これは、in vitroでの転写反応の効率を監視できます。
       注：in vitro転写反応でテンプレートの1μgあたりのRNAの約1μgを得られるはず。
3. ドットブロット分析
   プローブの濃度とDIG - UTPの取り込みは、ドットブロット分析（図2B）によって評価することができる。シリアルRNAの希釈液は、既知の濃度の標識されたコントロールRNAと並んで標準的なハイブリダイゼーション膜上にスポットされています。例えば、我々は、DIG - UTPはコントロールRNAプローブは、in vitro転写キット（ロシュ） でに含まれているラベルの付いた使用。正確な濃度を確立するために、各プローブに複数の希釈をテストするのが最善です。
   1. 70℃で1 × TBS緩衝液（100mMトリス- HCl pH7.5、150mMのNaCl）のブロッキング試薬の0.5％を溶解することによりブロッキング緩衝液を準備し、その後室温まで冷却ソリューションをしましょう​​。
   2. N +ナイロンメンブレン上のin vitro転写とコントロールプローブでの連続希釈のスポット1μlの（通常は10 ^{-1〜10 -5）。} UVクロスリンクすることにより、RNAを修正。
      注：膜の極小曲面は、後で必要なバッファの量を減らすために使用する必要があります。
   3. 振とう台上に室温（RT）で5分間1 × TBSで膜を平衡化させます。
   4. ブロッキングを使用して膜をブロック振とう台に室温で30分間バッファ。
   5. 5分間× 1 TBSで膜を洗浄します。
   6. 室温で45分間、1 × TBSの10mlに抗ジゴキシゲニン- APの1μlを希釈、抗DIG抗体とメンブレンをインキュベートします。
   7. 15分ごとに倍1X TBSで膜を洗浄してください。
   8. 5分間× 1 TNバッファー（100mMのトリス- HCl、pH9.5、100mMの塩化ナトリウム）でメンブレンを平衡化させます。
   9. 1 × TNバッファにNBT / BCIP 1 / 50（v / v）でインキュベートすることにより、膜を染色する。染色は、5〜10分を取ることができます。その後水でメンブレンをすすぎ、それを乾燥し、レコードとして保持することができます。
      注：NBT / BCIPは加水分解によって濃い青色色素を生成することを抗DIG抗体に結合したアルカリホスファターゼの基質である。

3。セクショニング

1. 室温にブロックを温める。ブロックは寒すぎるな場合は、個々のセクションでは、ワックス"リボン"を形成せずにロールオーバーすることがあります。台形にブロックをトリムはみ出し者の形状は、試料の周りにワックスの約1mm残す。
2. 35から37で大きなスライドウォーマー℃のウォームアップ
   注：多くのプロトコルは42で、この手順を行う° Cしかし35から37に温度を下げ° Cのセクションの下に泡の形成を防止する。
3. もはや2つの平行な面のが一番下になるようなミクロトームの上にブロックを置きます。慎重に刃を楽しみにブロックを持参し、ブロックの表面は刃と平行であることを確認してください。 8の厚さでセクション - 10μmの。ワックスのリボンは、興味のセクションを選択するために、このようなアルミ箔やろ紙のように、非粘着性表面上に整列させることができる。これは、近くの解剖顕微鏡を用いて評価することができる。
   注：組織のエオシン染色は、組織が適切に埋め込みの間に浸透されているかどうかを示す情報を提供します。ブロックの中心はエオジンで染色されていない場合、これは通常、組織が十分に固定されていることを示しています。
4. マークプローブオンプラスSL鉛筆でのIDE（ほとんどのペンまたはマーカーはin situハイブリダイゼーションのプロトコールの中に消去される）およびその上にきれいにミリQ H ₂ O 1mLのを配布する。慎重に（それが室温で作業する場合、水でセクションを操作する方が簡単です）、室温で水の表面上に興味のあるセクションをフロートさせます。光沢のある側（リボンはミクロトームの取れるように底面側）は水に直面していることを確認してください。その後暖かいスライドにゆっくりスライドを転送する。加熱は、セクションが水の表面に広がるのに役立ちます。 5分後、慎重に1つだけ滑らかな動きに水を捨てるので、リボンは、スライドの上にダウンして低下する。 37℃で少なくとも数時間または一晩のためにスライドを乾燥させて° C、その組織が付着する。
   注：組織切片が4の週に数日° Cのためにシリカの乾燥剤とボックスに格納することができる、しかし、できるだけ早くスライドを使用することをお勧めです。

（4） 原位置ハイブリッドで化

1. セクションの前処理
   各ソリューションに必要な量は明らかに処理され、コンテナのサイズが、使用するスライドの数に依存します。セクションは、常に完全に水没してください。 25スライドラックときちんとフィッティングコンテナの場合は、200〜250ミリリットルで十分です。インキュベーションステップの多くは非常に短いため、我々は通常、最初にすべての可能な解決策を準備してから、スライド前処理を開始します。しかし、無水酢酸溶液は、使用方法やプロテアーゼが使用時に追加される直前に準備する必要があります。特に記載がない限り、すべてのステップは室温で実施されています。また、すべてのバッファは、原液として10倍の濃度で調製する​​ことができる。
   1. 37℃にコンテナ内のプロテアーゼ緩衝液（100mMトリスpH8.0、50mMのEDTA）をウォーム
   2. 次のように、組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。
      
      • histoclear - 10分（ガラス皿を使用）
      • histoclear - 10分（使用ガラス皿）
      • 100％エタノール - 1分
      • 100％エタノール - 30秒
      • 95％エタノール - 30秒
      • 85％エタノール - 30秒
      • 70％エタノール - 30秒
      • 50％エタノール - 30秒
      • 30％エタノール - 30秒
      • 10％エタノール - 30秒
      • ミリQ H ₂ O - 1分
   3. 2分間1 × PBS中でインキュベートする。
   4. 250mlのプロテ​​アーゼバッファー予め温めておいた37℃と37℃で20分間スライドをインキュベート℃でプロテアーゼ50mg/mlの625μlを混合
      注：プロテアーゼは固定タンパク質を消化し、細胞のRNAのプローブへのアクセスを増やすために必要とされる。それが組織のブレークダウンすることなくハイブリダイゼーションシグナルを最大化するためにインキュベーションの時間を制御することが重要である、このようにいくつかの最適化は、各組織サンプルが必要な場合があります。
   5. 2分間の1X PBS、0.2％グリシンのプロテアーゼ活性を中和する。
   6. 2分間に一度1 × PBSでスライドを洗浄します。
   7. スライドiを扱うnは4％PFA溶液を10分間プロテアーゼ処理によって損傷することがRNAを再修正する。
   8. 2分ごとに、1 × PBSで2回スライドを洗浄します。
   9. スライドをPBSで洗っている間、236.25ミリリットルミリQ H ₂ Oに2Mトリエタノールアミン12.5mlの（100ミリリットルミリQ H ₂ Oの29.8グラム、HClでpH8.0）を混合して0.1 Mトリエタノールアミン液のpH8.0の250mlのを作るガラス皿インチでスライドを入れる直前にトリエタノールアミン緩衝液に1.25ミリリットルの無水酢酸を追加し、よくかき混ぜる。スライドを追加した後、10分間ゆっくりと攪拌し続ける。
      これは、スライドラックがトリエタノールアミン/無水酢酸の容器で上昇されている必要があります。我々は支持スタンドとクランプシステムを使用してください。
      注：このステップでは、プローブの非特異的な結合につながる可能性のある正に帯電したアミノ基がアセチル化され。また、無水酢酸は有毒であり、このソリューションは、したがって、ドラフト内で調製し、そして適切に処分する必要がある<。/ LI>
   10. 2分間の1X PBSで2回スライドを洗浄します。
   11. 再び組織切片を脱水する。
       
       • H ₂ O - 1分
       • 10％エタノール - 30秒
       • 30％エタノール - 30秒
       • 50％エタノール - 30秒
       • 70％エタノール - 30秒
       • 85％エタノール - 30秒
       • 95％エタノール - 30秒
       • 100％エタノール - 30秒
       • 100％エタノール - 30秒
       注：スライドを4℃に数時間のために下部に100％エタノールの量が少ない容器に保存することができます℃まで
2. 交配
   1. 85℃に加熱ブロックを温める
   2. ハイブリダイゼーションバッファーを準備します。 in situハイブリダイゼーション塩のファルコンチューブ1.25ミリリットル（3MのNaCl、100mMのトリス- HCl pH 8.0に、100mMのリン酸ナトリウムpH6.8、50mmのEDTA）で10 mlの混合のため、5 mLの脱イオンホルムアミド、2.5ミリリットル50パーセントデキストラン硫酸、250 μlの50倍デンハルト、125μlの100mg/mlのtRNA、と875μlのH _{2 O}
      注：デキストラン硫酸は非常に粘稠なので、° Cより簡単にピペッティングするために予熱して60〜ソリューションが最適です。ハイブリダイゼーション緩衝液は、-20℃で保管することができます
   3. 異なるプローブを準備します。各スライドの場合、9μlをミリQ H ₂ Oおよび10μlの脱イオンホルムアミドと1μlのプローブを混ぜる。 85プローブを加熱で2-3分間を、すぐに、氷上で冷やします簡単に遠心し、スライドごとに80μlのハイブリダイゼーションバッファーにプローブを追加します。ピペッティングでよく混ぜ、しかし泡を加えることは避けて。
      注：スライドごとに追加されるプローブの量は経験的にテストする必要があります。一般的に、プローブはは0.5 ng / KB /μLプローブの複雑さの最終濃度で使用されています。ハイブリダイゼーションは、スライドごとに100μlで行われるため、プローブの約25 ngの長さと1 - kbの長いプローブのスライドごとにプローブ50 ngのが0.5 - kbのあるプローブ用スライドごとに必要とされる。簡単にするために、私たちはしばしば0.5、1、およびスライド当たり4μlのプローブを試してみてください。
   4. 上のスライドを配置表面をきれいにし、それらの空気が5〜10分間完全に乾燥させます。スライドの右端上にピペットプローブ/ハイブリダイゼーションバッファーミックス。徐々にスライド上にカバースリップを下げる;ハイブリダイゼーション溶液は、任意の気泡なしすべてのセクションをカバーすることを確認して。泡がすべての組織切片から、それらを置換するために形成する、指で軽くカバーをタップします。このセクションに損傷を与えるので、カバーを外してスリップ引っ張らないでください。
      注：一般的にこのステップのために使用する代替方法は、同じプローブとインキュベートされる2つのスライドの"サンドイッチ"を準備することです。この方法の詳細については、refを参照してください。 14。
   5. 完全に平坦なプラスチック製のボックスで湿度のチャンバーを準備します。ワットマン紙とボックスの下部をカバーするには、MilliQ水で湿らせたパラフィルムはコーナーが発見残しと紙をカバーし、プラスチック製のボックスでスライドを配置し、しっかりとボックスをシール。
   6. 必要なハイブリダイゼーション温度、通常は50でスライドをインキュベート - 55 ° C、Fまたは16〜20時間。
   7. 翌朝を使用するために、55℃で1リットル0.2 × SSCを準備し、これを保存するさらに、37℃で1リットルNTE緩衝液（0.5MのNaCl、10mMのTris - HCl pH7.5、1mMのEDTA pH8.0）とストアを準備℃に
3. ポストハイブリダイゼーション治療
   1. セクションを損傷しないように慎重にカバースリップを取り除きます。ラックにスライドを置き、一時間55℃で0.2 × SSCで二度それらを洗ってください。
      注：スライドを縦に配置されるときにカバーグラスは、しばしば簡単に落ちる。カバースリップが添付されたままの場合は、カバースリップを洗い落とすために1または2分間のウォーム0.2 × SSC中でスライドを浸す。このセクションへの損害を引き起こす可能性があるとして、スライドのカバースリップを引いて避けてください。
   2. その間に、500 mlの洗浄バッファー（1％BSA、TBS緩衝液で0.3％のトリトン）、100 mlのブロッキング溶液（0.5％TBSバッファーでブロッキング試薬）を準備する。徐々に70に加熱されるTBSにブロッキング粉をかき混ぜる℃、それが室温に冷却させますdissolv回ED。
      注：必要に応じて洗浄バッファーやブロッキング液の量は、ステップ4.3.8 -11で使用されている平らなプラスチックの箱のサイズによって異なります。それは完全にトリトンを溶解するためにしばらく時間がかかるので、事前に十分な溶液を調製。
   3. 2分間1X NTEでスライドを平衡化させます。
   4. RNアーゼに20μg/mlRNアーゼが直前に使用する追加されたために1 × NTEバッファーにスライドを転送することで治療を続行、37℃で30分間を。
      注：RNA分解酵素RNA二重鎖のミスマッチで切断遊離一本鎖RNAと同様に。このステップでは、切断されたプローブのフラグメントが最後に0.2 × SSC洗浄（4.3.6を参照）で洗い流されているように、プローブの非特異的結合のレベルを減らすのに役立ちます。
   5. 2分ごとに1X NTEで二回スライドを洗浄します。
   6. 一時間55℃で新鮮な0.2 × SSC中でスライドを洗う。
   7. 室温で5分間、1 × PBSでスライドを平衡化させます。
   8. 目の上にラックからスライドを転送するeの平らなプラスチックの箱の底とブロッキング溶液の最小限の量でそれらをカバーしています。ゆっくりと振とう台上で45分間、スライドをブロックします。
   9. 第二クリーンなフラットなプラスチックボックスにスライドを移し、振とう台に洗浄バッファーで45分間それらを洗う。
   10. 抗体のインキュベーションに進みます。バッファ（1:5 v / v）の洗浄に抗ジゴキシゲニン抗体を希釈し、いずれかの各スライドに直接最小の音量を適用したり、平らなプラスチック製のボックスにスライドを配置し、抗体溶液の最小限の量でそれらをカバーしています。 4℃、室温または一晩で2-3時間℃で暗所でスライドをインキュベート
   11. スライドのプラットフォームを振っての洗浄バッファーで15分間ずつ4回洗浄する。洗浄緩衝液とフラットプラスチックのボックスの最小量を使用してください。洗浄の各間にプラスチック製のボックスを清掃してください。
       注：洗浄の間のボックスの清掃は、スライド上の一般的なバックグラウンドを減少されます。これを簡素化するために、我々は2つ​​の同一のフラットボックスを使うと各洗浄後にきれいなボックスにスライドを移す。
   12. 2分間1 × TBSにスライドを移す。
   13. 2分ごとに倍TNバッファーでスライドを平衡化させます。
   14. 1ミリリットルTNバッファー当たり20μlのNBT / BCIPを追加することで、使用する直前に染色液を準備します。小さなプラスチック製秤量皿中の染色液を注ぐ。サンドイッチ二人はお互いに直面しているセクションと一緒にスライドします。毛管現象は、解決策をプルできるように、溶液中でサンドイッチの一長辺をつけます。キムワイプ上でスライドを排出し、再び抗体溶液にスライドを埋める。あなたは解決策がバブルを避けるために流れるようにスライドをタップする必要がある場合があります。暗所で室温でプラスチックボックスや店舗でスライドを置きます。
   15. 15日目の10日目：TNバッファーでスライドを洗浄し、新鮮な染色液を含む新しいサンドイッチを準備することによって1-5日1日2回更新染色液。
       注：定期的にint型で染色液を交換ervalsは、バックグラウンド比の信号が向上します。信号の開発は、化合物またはステレオ顕微鏡下で監視することができます。彼らは染色のラウンド間にテネシー州のバッファ内にあるか一度、それらがちょうど永久的な取付け前に水の中に転送される間、それは、セクションを撮影することが可能です。
4. 取り付け
   1. 信号が明らかになると、ミリQ H ₂ Oでスライドをリンスし、エタノール系列を通して、それらを迅速に脱水：
      
      • 10％エタノール - 10秒
      • 30％エタノール - 10秒
      • 50％エタノール - 10秒
      • 70％エタノール - 5秒
      • 80％エタノール - 5秒
      • 95％エタノール - 5秒
      • 100％エタノール - 5秒
      • histoclear - 2分
      • histoclear - 2分
      注意：信号がエタノールに可溶であるとして、これらのインキュベーション時間のそれぞれを簡潔にするために確認してください。
   2. スライドごとにトルエンベースの封入剤の1つまたは2つの滴を配置することでスライドをマウントします。eと徐々に気泡の形成を回避スライドにカバースリップを低減。複合顕微鏡の下で結果を分析する前に一晩封入剤硬化をしましょう​​。マウントされたスライドを室温で年間保存することができます。

5。代表的な結果：

1-5日後に、赤紫色の信号はプローブが相補的な転写産物（図1）にハイブリダイズしているそれらのセル内の開発を行います。色信号は、このように目的の遺伝子の発現パターンの細胞の解像度で直接可視化を提供します。弱いバックグラウンド染色は、植物組織（図3）のプローブや染色の非特異的結合に起因する、開発することがあります。このような背景の信号は、組織の小さい、少ない決定細胞に比較的顕著かもしれませんが、バックグラウンドの染色も陰性および陽性コントロールプローブにハイブリダイズセクションで観察していないでしょうされる実験間の再現性である。

図1。代表的な結果は、 シロイヌナズナとトウモロコシの組織上の異なるプローブで得られる 。 シロイヌナズナの in situハイブリダイゼーション（AD）とトウモロコシ（EH）の組織で概説プロトコルが正常に完了した場合、予想される結果の種類を示す明確な遺伝子特異的プローブと。 （A） シロイヌナズナ植物茎頂のSHOOTMERISTEMLESS1（STM）のローカライズは、分裂組織およびその周辺の葉における信号の欠如の不定細胞に紫青の信号の有無に注意してください。いくつかの胚性幹細胞でCLAVATA3（B）の発現を示すシロイヌナズナ魚雷段階の胚の（BD）セクションは、AtML1（C）表皮層で発現し、セクションの信号の欠如は、ランダムなネガティブコントロールRNA（Dでプローブ）。開発トウモロコシの胚におけるSTMのホモログのknotted1の（E）のローカリゼーション、胚分裂組織と根で特に強いシグナルに注意してください。 arf3a（F）とocl4（G）およびネガティブコントロールプローブ（H）のための無のハイブリダイゼーションシグナルのためのin situハイブリダイゼーションパターンの異なる示すトウモロコシから栄養期茎頂から（FH）縦断。 AtML1ホモログocl4が表皮に特異的に発現される一方arf3aは、背軸/ボトム葉の表面に発現しています。

STM：：アミノ酸81を包含するcDNA領域- 382、保存されたホメオドメインが含まれ、CLV3：以下の遺伝子断片をプローブとして使用された完全長cDNA、AtML1：三番目のエクソンを、KN1：全オープンリーディングフレーム、arf3a：ヌクレオチド9 - cDNAクローンHM004539 225; ocl4：いくつかの保存されたタンパク質のドメインを含む完全長cDNAの3'1.7キロバイト、。

図2。 in vitro転写のプローブにしながらポイントを確認する 。 （）in situハイブリダイゼーションのプローブでは、炭酸塩の加水分解した場合、必要な-（C）としたときの後、DNase処理及びin vitro転写反応（B） でのその後の精製後、in vitro転写（） の後に標準的なアガロースゲルでチェックされます使用（D）の準備ができて。このようなプローブ1のような長さで250bpの、上のプローブの場合は、炭酸塩の加水分解は、より小さいプローブフラグメント（ブラケット）の範囲を得られます。 （B）ドットブロット分析により、プローブの比色定量。 100 ng /μLのコントロールプローブ（1）の三の10 ^-1から10 ^-5の範囲で希釈新たにDIGラベルされたプローブは、（2-4）、転写膜上にスポット抗DIG抗体とインキュベートし、そしてアッセイされるプロトコルのセクション2.3で概説した比色アッセイを用いて。分析は示唆している以下の推定濃度：プローブ2、〜は100 ng /μL、プローブ3、〜10 ng /μLのプローブ4、〜1 ng /μLの。プローブ4は、in situハイブリダイゼーションのシグナルに良いを得ることはほとんどありません。

図3。よくワーキングプローブの非特異的なプローブの比較 。非特異的バックグラウンド信号（A）と外側の細胞層（B）でOCL5プローブのin situハイブリダイゼーションのシグナルの特定を示すトウモロコシから栄養期茎頂を介して縦セクション。

図4。 in situハイブリダイゼーションのプロトコールのステップのタイムラインを示す図 。組織の埋め込 ​​み手順は緑色、オレンジ色のプローブの準備の手順、および青のin situハイブリダイゼーションのステップでで示されています。このタイムラインは、DNA templaと考えているプローブのin vitro転写のためのTEが可能です。パラフィン包埋組織ブロックとDIGラベルされたプローブは、使用時まで、° Cおよび-80 ° C、それぞれ4で事前に準備して格納することができます。 in situハイブリダイゼーションのプロトコールにしてわずか4日間で完了することができます。

Discussion

ここで概説したin situハイブリダイゼーション法偉大な携帯電話の解像度、高感度および特異性に関心の任意の遺伝子の時空間発現パターンの直接可視化することができます。プロトコルは、遺伝子間の発現レベルの定量的な比較を許可しません。しかし、法の高感度と分解能は、遺伝子発現を解析の大部分の他の方法では不可能な組織^8、18、内遺伝子発現の勾配を明らかにすることができます。

プロトコルは、トラブルシューティングが問題にすることができます多くの手順が含まれています。プロトコルの最も重要なステップは、組織の固定とプローブの選択とラベリングです。低DIGの取り込みと不完全浸透し組織とプローブは、バックグラウンドの上に検出することが困難になる可能性のある非常に微弱な信号が得られます。興味の各々の新しい遺伝子の場合、それはdiffeから派生したいくつかの異なるプローブを試してみることをお勧め転写産物の領域を借りる。時折、遺伝子の別の小さな領域を標的とする二、三のプローブが強いと、特定のハイブリダイゼーションシグナルを得るために組み合わせることが必要な場合があります。さらに、そのような温度およびハイブリダイゼーションバッファーの組成などのハイブリダイゼーション条件は、、それぞれの遺伝子またはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げるか上げるために組織を最適化することができます。また、プロテアーゼ処理のステップは、変数であり、異なる植物種のためにまたは非常に低濃度と転写産物を検出するためのプロトコルを適合させるために変更することができます。両方陽性および陰性コントロールプローブの包含は、プロトコルの問題のポイントを識別する助けになるでしょう。

手順は、パラフィン包埋植物の組織切片用が若干変更して最適化されてin situハイブリダイゼーションホールマウントにも使用できます。広く動物研究¹⁹で使用されているが、in situハイブリダイゼーション全体のマウントはLになりますこのような胚、根や若い分裂組織^20,21として簡単に潜入することができるの植物組織、にimited。プロトコルは、簡単に同時に二つの異なるmRNAを検出したり、蛋白質^15,22,23と一緒に成績証明書をローカライズするために変更することができます。最後に、それは、植物におけるsmall RNAの発現パターンの可視化には、このメソッドのアプリケーションを拡張することが可能です。 miRNAの発現パターンは、トウモロコシとシロイヌナズナ^8,14の両方でこのプロトコルを使用して決定されている。さらに最近では、in vitro転写されたプローブで 、市販のロックされた核酸（LNA）信号の感度^18、24を増加させるオリゴプローブのDIG標識に置き換えられています^。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
製品	会社	カタログ番号	解説
Cytoseal 60 4オンス	フィッシャー	23-244-256	トルエンベースの8310から4
Histoclear	フィッシャー	50-899-90147
組織パスParaplastプラス	フィッシャー	23-021-400
N +ナイロンメンブレンハイボンド- N +	GEヘルスケア	RPN203B
RNaseのOUT、40 U /μL	インビトロジェン	10777019
RQ1 RNaseフリーのDNase、1 U /μlの	プロメガ	M6101
DIGラベルされたコントロールRNA	ロッシュ	11585746910
DIG RNAラベリングミックス	ロッシュ	11277073910
SP6 RNAポリメラーゼ1,000 U	ロッシュ	10810274001
T3 RNAポリメラーゼ1,000 U	ロッシュ	11031163001
T7 RNAポリメラーゼ1,000 U	ロッシュ	10881767001
のRNase	ロッシュ	109142	グリセロール50パーセントトリス100mMのpH8.0で溶解する
ブロッキング試薬	ロッシュ	1 096 176	° C TBSバッファーで70までの耐熱
羊150 Uから抗ジゴキシゲニン- AP、Fabフラグメント	ロッシュ	1 093 274
NBT / BCIPストック溶液	ロッシュ	1 681 451
ミニクイックスピンRNAカラム	ロッシュ	11814427001
E.からtRNAの大腸菌	ロッシュ	109541
トリトン® X - 100	シグマ	T8787
Tween - 20を	シグマ	P9416
脱イオン化ホルムアミド	シグマ	F9037
放線griseusタイプXIVからのプロテアーゼ	シグマ	P5147	37 MilliQ水とプレダイジェストで希釈して4時間° C
トリエタノールアミン	シグマ	90279	水で希釈し、HClでpH8.0にもたらす
無水酢酸	シグマ	A6404
ロイコノストック属からデキストラン硫酸のナトリウム塩。	シグマ	D8906 - 5G	デキストラン硫酸℃で溶解するために80にまで加熱する必要があります。
デンハルト溶液の50倍の濃縮	シグマ	D2532
ウシ血清からアルブミン - ≥98％	シグマ	A7906
エオシンY二ナトリウム塩	シグマ	E4382	飽和するまで96〜100％エタノールに溶解する
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148
エタノール絶対200プルーフ
フェノール/クロロホルム
ベース型	電子Microsocpy科学	62352〜15
埋め込みリング	フィッシャー	22-038-197
キャップと20ミリリットル使い捨てシンチレーションバイアル、	VWR	66020-326
プローブオンプラススラ​​イド	フィッシャー	22-230-900
マイクロカバーガラス24x50ミリメートル	VWR	48404-452
ワットマン濾紙3ミリメートル	VWR	89022-360
三ガラス皿一STAInlessスチールスライドラック	電子Microsocpy科学	71420〜25	二つのガラスはhistoclear治療のために必要なくぼみと最後のものは、無水酢酸の治療のために使用されています
18清潔なプラス​​チック容器	電子Microsocpy科学	71402
密閉式蓋つきの2つまたは3つの大型フラットプラスチックの箱			ハイブリダイゼーションおよび抗体の手順では必要
ファインブラシ			ワックスリボンを渡すのに役立ちます
ミクロトーム			ライカ
セルフクリーニングドライ真空システム	ウェルチ	2025
ウォーマーをスライドさせ	フィッシャー
加熱ブロック			60 ° Cおよび85 ° Cで必要
58〜60時インキュベーター° C	フィッシャー		溶融Paraplastと手順について
55 ° Cと37 ° Cのオーブンまたは水浴	フィッシャー		温度の間にクイックチェンジによる2を必要とする
遠心（4 ° C - 20 ° C）
ドラフト