リフトバレー熱ウイルスMP - 12ワクチン株の逆遺伝学的システムは、追加のMP - 12の増加減衰および免疫原性と変異体を作成するための便利なツールです。我々はNSS変異株を生成し、特徴付けるためにプロトコルについて説明します。
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方法論記事
リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して
この記事について
サマリー
要約
出血熱、神経疾患やヒトの失明、そして高レートの中絶と反芻動物1の胎児の奇形を引き起こすリフトバレー熱ウイルス（RVFV）は、選択剤とリスクグループ3の病原体を重ねるHHS / USDAとして分類されている。それは、ブニヤウイルス科の属Phlebovirusに属し、このファミリーの中で最も毒性の強いメンバーの一人です。 RVFV MP - 12ワクチン株2,3だけでなく、ZH548とZH501を含む野生型RVFV株4-6、、のためのいくつかのリバースジェネティクスシステムが2006年から開発されている。 MP - 12株は、（リスクグループ2病原体および非選択剤である）のM -およびL -セグメントでいくつかの変異によって高度に弱毒化ですが、それでも機能的な病原性をコード病原性S -セグメントRNA 3を 、運ぶ要因、NSS。それはとしてeffic複製しながらNSS ORFの欠失、フレームの69％を運ぶrMP12 - C13type（C13type）は、すべての既知のNSSの機能を欠いているIENTは、VeroE6細胞におけるMP - 12は、タイプ- I IFNを欠いていません。 NSSは、インターフェロン（IFN）-βmRNAの7,8を含むホストの転写のシャットオフを誘導し、翻訳後レベルでの二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）の分解を促進する。9,10 IFN -βの転写であるインターフェロン調節因子3（IRF - 3）、NF - kBからアクチベーター蛋白質1（AP - 1）、およびIFN-alpha/beta受容体へのIFN -βの結合（IFNAR）によって上方制御は、IFN -αの転写を刺激するNSSによるIFN -β遺伝子を含むホストの転写抑制はウイルス複製に応答してそれらのISGsの遺伝子のupregulationsを防ぐ一方で、宿主の抗ウイルス活性を誘導する遺伝子または他のインターフェロン刺激遺伝子（ISGs）11、もののIRF - 3、NF - kBから活性化因子タンパク質- 1（AP - 1）RVFV7によって活性化することができます。 。このように、NSSはさらにMP - 12を減衰させる、およびIFN -β抑制機能を廃止することによって宿主自然免疫応答を高めるために優秀なターゲットです。ここ、我々は組換えMP - 12エンコーディング変異NSSを生成するためのプロトコルを記述し、IFN -βmRNAの合成を抑制する機能を欠いているNSS変異体を同定するためのスクリーニング方法の例を提供しています。自然免疫におけるその重要な役割に加えて、I型IFNは、樹状細胞と適応免疫応答12-14誘導の成熟にとって重要です。従って、I型IFNを誘導するNSSの変異体は、さらに減衰されますが、同時にそれらのワクチン接種のアプローチのための理想的な候補になる野生型MP - 12、より宿主の免疫応答を刺激するより効率的です。
プロトコル
1。プラスミドDNAから組換えMP - 12エンコーディングのNSSの変異（S）2の回収
- スプレッドベビーハムスター腎臓（BHK）最小必須培地（MEM）-α（Invitrogen社、カタログ番号32561037）を含む10％ウシ胎児血清（FBS 6 cmのディッシュに安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼ/ T7 - 9細胞15、、 ）、ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100μg/ mlの）（Invitrogen社、カタログ番号15140122）、およびハイグロマイシンB 600μg/ mlの（Cellgro、猫＃30 - 240 - CR）。
*ウイルスの回収効率は35 - mmディッシュに比べて6 cmの皿に高いです。低継代レベルでBHK/T7-9細胞は回復のより高いレートをサポートしています。また、他のBHK細胞株は安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼは、4,5,16,17を使用することができること。 - 細胞がコンフルエントに70〜80％に到達したら、10％FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシンを（ハイグロマイシンBを含まない）を含むMEM -α新鮮で培養上清を交換してください。
*細胞はtransfecteはずですT7 RNAポリメラーゼの発現の消失を防ぐために培地を交換した後1時間以内にD。
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ディスカッション
RVFVのために遺伝学のシステムを逆には、T7プロモーター2,4,5またはマウス3またはヒトの4 POL - Iプロモーターを利用していくつかのグループによって開発されている。この原稿では、我々はBHK/T7-9セル15その安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼを用いて組換えRVFV MP - 12株を生成するためのプロトコルについて説明します。 BHK/T7-9細胞の状態によって異なるウイルス回収の効率化、プラスミドの量は、トランスフェクションされた細胞の数など。我々は、常に実験のために高力価のウイルスストックを得るためにベロE6細胞でP0ウイルスを増幅する。そのような人間の肺の二倍体（MRC - 5）細胞などのタイプ- I IFN -コンピテントセルは、NSSは、I型IFNやPKRを含む阻害抗ウイルス活動による効率的なウイルスの複製をサポートして機能する場合にのみ、ウイルス増幅を使用することができる。
プラークアッセイでは、MP - 12とNSS変異体を滴定するための非常に有用な方法です.......
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開示事項
我々は、開示することは何もない。
謝辞
この作品は、グラントの数5エクセレンスの西部地域センター（WRCE）を通じて、U54 AI057156 - 07、アレルギーや国立感染症研究所から1 R01 AI08764301 - A1、および大学のワクチン開発のためのシーリーセンターの内部資金によって賄われていたテキサスメディカルブランチ。
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材料
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| 最小必須培地（MEM）、アルファ | インビトロジェン | 32561037 | |
| ダルベッコ改変最小必須培地 | インビトロジェン | 11965092 | |
| 改変イーグル培地（MEM 2倍） | インビトロジェン | 11935046 | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | インビトロジェン | 15140122 | |
| ハイグロマイシンB | Cellgro | 30から240 - CR | |
| トリプトースリン酸塩スープ | MPのバイオメディカル | 1682149 | |
| Noble寒天 | VWR | 101170-362 | |
| トランジット- LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| のOpti - MEM | インビトロジェン | 31985070 | |
| エアロゾルタイトな蓋 | エッペンドルフ | C - 2223〜25 | |
| 0.33パーセントニュートラルレッド溶液 | シグマアルドリッチ | N2889 - 100ML | |
| C57/WT MEF細胞 | InvivoGen | MEF - c57wt | |
| ブラストサイジンS | InvivoGen | ANT - BL - 1 | |
| ゼオシン | InvivoGen | アリ - 亜鉛- 1 | |
| 定量ブルー | InvivoGen | REP - QB1 | |
| BHK/T7-9細胞15 | 岐阜大学、日本 | ||
| ベロE6細胞 | ATCC | CRL - 1586 |
参考文献
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, an....
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再版と許可
