両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 - リガンド相互作用の動力学を測定するための接着の周波数分析が記載されている。この機械的にベースのアッセイは、相互作用する受容体とリガンドと密着センサーとインテグリンαLβ2と細胞間接着分子-1のようなマイクロピペット、加圧されたヒト赤血球を用いて例示される。
この記事について
サマリー
要約
マイクロピペットの接着アッセイは、2次元（2D）受容体-リガンド結合速度1を測定するために、1998年に開発されました。アッセイは接着センサーと相互作用する分子のいずれかの提示細胞としてのヒト赤血球（RBC）を使用しています。それは正確に制御領域との結合形成を可能にするための時間と他の相互作用する分子を発現し、他の細胞と接触RBCを持って来るためにマイクロマニピュレーションを採用しています。接着イベントは離れた二つのセルを引っ張って上RBCの伸長として検出されます。赤血球表面上に固定化されたリガンドの密度を制御することにより、密着性の確率は0と1の間のミッドレンジ内に保持されます。付着確率は、所定の接触時間の2つの細胞間の繰り返し接触サイクルの順序で接着事象の頻度から推定される。接触時間を変化させることで結合曲線を生成します。結合する受容体-リガンドの反応速度論1の確率モデルのフィット曲線は、2次元親和性とオフレートを返します。
アッセイは、IgGのFc 1-6、複合糖質リガンド6-9、配位子10-13、homotypicalカドヘリン結合14、ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体15とT細胞受容体とレセプターとのインテグリンとセレクチンとのFcγ受容体の相互作用を用いて検証されています- 19。
メソッドは、このような膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9曲20、インピンジメント力20、ならびに生化学的要因として生物物理学的な要因によって2D速度の規制を定量化するために使用されていますこのような相互作用する分子が存在し、これらの分子15,17,19の表面の組織細胞骨格と膜の微小環境の変調器として。
方法は、tをも使用されていますOは、修正モデル21を使用してデュアル受容体-リガンドの種3,4の同時結合、および19 trimolecular相互作用を研究する。
法の大きな長所は、それが彼らのネイティブな膜環境での受容体の研究をできることです。結果は、精製された受容体17を用いて得られたものとは大きく異なる可能性があります。また、よく典型的な生化学的方法を超えて時間分解能を持つサブ秒の時間スケールにおける受容体 - リガンド相互作用の研究が可能になります。
マイクロピペットの接着周波数の方式を説明するために、我々はαLβ2をアクティブにするために溶液中で二量体のE -セレクチンと好中球上のインテグリンαLβ2に結合赤血球の官能細胞間接着分子1（ICAM - 1）の動態の測定を示す。
プロトコル
1。全血から赤血球を分離
- EAS - 45溶液を調製。 表Iからすべての成分を秤量し、純水の100〜200ミリリットルに溶解する。千ミリリットルソリューションを作成し、pHを8.0に調整するために水を加えます。 50ミリリットルでフィルタと注し。ストレージ用に-20℃で凍結する。
注：ステップ1.2は、プロトコルを承認された治験審査委員会で、このような看護師として訓練を受けた医療専門家が行ってください。
- EDTAを含有する10mlのチューブに肘正中皮静脈からの血液の3〜5ミリリットルを描き、優しく直ちにEDTAと血液を混合し、完全に凝固しないように。
- プロセスの血液サンプルをできるだけ早く。遠心分離以外のすべての次の手順は、準備が無菌に保つためにフードの下で行われる必要があります。 、50ミリリットル遠心管に血液を移す5分@ 1000rpm、4℃で寒さと無菌1077 Histopaqueと遠心10mlのを追加します。二回繰り返します。
- 10を加算mlの冷と滅菌PBS、5分@ 1000rpmのための遠心、4℃上清を取り除く。 4回（5回の合計）を繰り返します。
- 二回滅菌EAS - 45（5分@ 1000rpm、4℃）で洗浄する。最後の洗浄の移動の赤血球中に新しい滅菌15ミリリットルチューブに。
- 再懸濁し、赤血球in10ml EAS - 45。
2。赤血球のビオチン化
- ステップ1からの赤血球とチューブを取る。 5分@ 1000rpm、4℃で遠心分離後上清を取り除くいくつかのバイアルの各々に赤血球ペレット10μlを入れ、（6種類の赤血球のビオチン濃度の調製例については、 表IIを参照）各バイアルにPBSの対応する量を加える。
- 表IIによれば、新鮮なBiotin-X-NHS/DMF 1:10、1:100希釈を行う。
- 各バイアルに0.1Mホウ酸緩衝液10μlを追加します。
- すぐに計算された各バイアルにビオチン溶液の量（例として表IIを参照）、ボルテックスを追加。
- 各赤血球のバイアルを配置50ミリリットルコニカルチューブと室温で30分間ローテーターでインキュベート内側。
- 2分@ 2000rpm用EAS - 45の800μlに各バイアルを3回洗浄。
- 4の各バイアルと店舗℃にEAS - 45の100μLを加える最終的なソリューションの各1μlのに今赤血球の〜1mlnでなければなりません。
3。赤血球にビオチン架橋配位子の*を官能
- 製造元の指示に従って、2mg/mlストレプトアビジン溶液を調製します。 Aliqouted溶液を-20℃で保存することができます
- すぐにストレプトアビジン溶液を、ボルテックスでステップ2.7（10μL）から赤血球の同量を混合し、4℃で30分間ローテーターでインキュベート℃に
- 2分@ 2000rpm用EAS - 45の500μLで3回洗浄する。 15μlEAS - 45ストレージ用/ 1％BSAを追加。
- すぐに20μg/mlリガンド溶液、渦とステップ3.3（10μL）から赤血球の同量を混合し、室温で30分間ローテーターでインキュベートする。
- の500μLで2回洗浄するEAS -2分@ 2000rpmは45 / 1％BSA。ストレージ用EAS - 45 / 1％BSAの15μlを追加。
目的タンパク質は、タンパク質のビオチン化のための市販のキットのいずれか（例えば、サーモサイエンティフィック＃21955 EZ -リンクマイクロNHS - PEG4 -ビオチン標識キット）を使用するか示すように中間ステップとして、ビオチン化捕捉抗体を使用できる、ビオチンのリンクがない場合*ビデオインチ
4。受容体とリガンド密度の定量化
- それぞれのモノクローナル抗体の飽和濃度の異なるバイアル、受容体を有する細胞において、室温で30分間、ステップ3からリガンドでコーティングされた赤血球をインキュベートし。制御とは無関係アイソタイプ適合抗体で別々のバイアルの細胞でインキュベートする。一次抗体が蛍光標識されていない場合は、製造元の指示に従って蛍光標識二次抗体でインキュベートする。
- 対応する蛍光CALとフローcytometeryでステップ4.1で調製したサンプルを分析するibrationビーズ。図に示すように密度を計算する。 1。
5。マイクロピペットおよびセルチャンバーのための準備
- PN - 30ナリシゲ"磁気ガラス管微小電極水平プラーまたはサターインスツルメンツマイクロピペットプラーを使用して、キャピラリーチューブからマイクロピペットを引き出します。
- 希望のサイズ（通常は1 -5μm以下から必要な直径の範囲の研究で使用するセルのサイズに依存）に引っ張らマイクロピペットの先端を調整するマイクロフォージでマニピュレータを使用してください。
- 希望のサイズに顕微鏡のカバーガラスを切断することにより、セルチャンバーを準備。実験中に浸透圧を変更するには培地の蒸発を防ぐために両側からミネラルオイルを使用してチャンバーを密閉する。
- チャンバーへの受容体とリガンド有利子細胞を追加。
6。マイクロピペットの接着周波数分析
- それぞれのピペットで相互作用する細胞を吸引し、コンピュータにプログラムさpiezoelectrを使用してください ICのトランスレータは、制御された接触面積と時間で他の細胞と接触してアウトのRBCを駆動する。細胞の分離時にRBCの伸長を観察することによって、接着事象を検出する。
- 所定の接触時間、接触収縮のサイクルを50〜100倍を繰り返します。 Excelスプレッドシートの列のない接着用接着または"0"のために"1"を追加して観測された付着のイベントを記録します。あなたは、顕微鏡画像については、例えば、デジタルメディアやビデオテープを記録装置を使用することができます。
- 接着周波数に対する平均値とSEMを取得するには、各接触時間のために少なくとも3つの異なるセルのペアを使用して接触時間曲線を記録します。
- 無関係のリガンド（例えばBSA）および/またはそれらの特定の機能的な封鎖のモノクローナル抗体を用いてリガンドまたは受容体を遮断することでコーティングされた赤血球を使用して、コントロールのための非特異的結合曲線を記録します。各接触時間の時点で特定の接着周波数は非特異的な接着周波数1を除去することによって計算することができます。
- 特定の接着周波数を合わせるP前方に二階と一階受容体の単一種と配位子1の単一種の間に逆、シングルステップの対話を記述する確率モデル（式1）により、対の接触時間 t のデータ：
2D効果的な結合親和性であるここで、K、kは オフオフレートである、M RとM Lは、手順4で測定されたそれぞれの受容体とリガンド密度、c は接触面積である。カーブフィットは、CとKの2つのパラメータ、C K AとK から 、ひとまとめにし、効果的な2Dの親和性と総称と呼ばれるている。オフレートとその製品は、効果的な2次元上のレートです。 C K 上 = A C K x kでオフ 。
特定の接着周波数Pの合計を測定接着（P 測定 ）1,21をから非特異的接着の割合（P 非特異的 ）の減算によって計算される。
8。代表的な結果：
好中球上のインテグリンαLβ2サイトの密度の1決定図 。好中球は、最初に図3,4にまたはE -セレクチン- Igをせずに使用される実験条件に一致する10分のためのE -セレクチン- Igの1μg/mlのとインキュベートし、その後、PE標識抗の飽和濃度（10μg/ml）とされたヒトCD11aモノクローナル抗体（クローンHI111、 特定の表を参照してください試薬と装置）や制御のための無関係のマウスIgG1は、洗浄し、直ちに分析した。サンプルは標準QuantiBRITE PEのキャリブレーションビーズのBD LSRのフローサイトメーターで読み取った。パネルは、E -セレクチン- Igの処理（青色）または未処理の細胞（緑色）のものと一緒にキャリブレーションビーズの蛍光ヒストグラム（ピンク）を示します。特定のCD11aモノクローナル抗体の染色が実線で示されており、無関係なアイソタイプ適合コントロール抗体の染色は点線の曲線で示されています。未処理の細胞との比較から見て、E -セレクチン- Igは（すべての洗浄ステップでとFACS緩衝液中の存在）で処理した細胞はCD11aの密度に影響を与えなかった。パネルBは、密度の定量化のプロセスを示しています。 LOG10は、パネル（ピンクの円）とビーズあたりのロット別のPE分子（メーカーから）のための4つのキャリブレーションビーズのヒストグラムの各ピーク値の平均蛍光強度（FI）を算出した。 LOG10 fluorescに対するビーズ当たりLOG10 PE分子の線形回帰リファレンスはプロットした。 respectivly、E -セレクチン処理した細胞に対して特異的mAbおよびコントロール抗体のための3.99（青実線丸）と2.23（青白丸）に等しいLOG10 FI（y）の値。我々はPEとしては、x（値はパネルBの緑と青の円としてプロットされている）X = LOG10 PE /セルの線形方程式を解くと：モノクローナル抗体の比は1:1であった、好中球上のαLβ2の合計数があった9587として算出。面密度は、好中球の直径22として8.4μmを使用して、43分子/μm2であると計算された。 ICAM - 1の密度も同様に65モル/μm2のに匹敵PE -抗ヒトCD54モノクローナル抗体を、使用してフローのcytometeryによって測定した。
図2 マイクロピペットのシステムの回路図 。私たちのマイクロピペットシステムは、家の中で組み立てられ、3つのサブシステムで構成されて：イメージングサブシステムを一つ、RECを観察できるようにするORDとマイクロピペット - 吸引された細胞の動きを分析し、一つのマイクロピペットに細胞を吸引できるように、セルチャンバーから細胞を選択するときは、1つ、および圧力のサブシステムを有効にするためにマイクロマニピュレーションのサブシステムを。イメージングシステムの中心部分は、100倍の油浸1.25 NAの目的で顕微鏡（オリンパスIMT - 2 IMT2を）反転されます。画像は、電荷結合デバイス（CCD）カメラを介してビデオカセットレコーダーに送信されます。ビデオのタイマーは時間を追跡するシステムに結合されている。各マイクロピペットを顕微鏡に装着され、細かく三軸油圧マイクロマニピュレーターと位置付け、機械的駆動によって操作することができます。ニューポートからの機械的なマニピュレータも使用可能です。マイクロピペットホルダーの一つは、圧電変換器にマウントされている、のドライバは、ピエゾアクチュエータに電圧アンプ（自家製）を介してDAQボードを介してコンピュータLabVIEWコード（リクエストを承ります）と信号の変換によって制御されます。このllows接着試験サイクルで正確にかつ繰り返ピペットを移動一つ。圧力調整のサブシステムは、実験中に吸引を制御するために使用されます。油圧ラインが流体リザーバへのマイクロピペットホルダーを接続します。微細な機械的な位置決めは、貯水池の高さを正確に操作することができます。
マイクロピペットはKIMAXの融点のホウケイ酸ガラス毛細管（1.0の外径± 0.07 mmと0.7の内径± 0.07 mmを使用して生成されます。まず、キャピラリーチューブからマイクロピペットをナリシゲ"磁気ガラス管微小電極水平プラーPN - 30を使用して引っ張られている（サッターインスツルメンツマイクロピペットプラーは、別の引き手のオプションです）。第二に、マイクロフォージシステムは、（家の中で構築された）目的のサイズの開口部にマイクロピペットをカットするために使用されます。マイクロフォージシステムの商用モデルもご用意しています。
実験、microsc中にマイクロピペットの振動を避けるためにOPE、マニピュレーターと共に、エアサスペンションのテーブルの上に置かれている。
ICAM - 1（）またはhIgG（Bでコーティングされた赤血球の間で繰り返される接着試験サイクルから測定された（）と非特異的な（B）1S（赤）と10秒（青）で結合接触時間のための接着の周波数 f i を実行して図3 ）ヒト好中球はインテグリンαLβ2を表す。F I =（X 1 + X 2 + ... + X iを持つ）/ I（1≤i≤nの）、 私は、テストサイクルのインデックスです、X iは "1"となります（付着）または"0"（無接着）。F n回 （n = 50）が付着確率のための最良の推定値として使用されました。
4カイネティクスを図好中球のインテグリンαLβ2（にICAM - 1結合
）。各接触時に3つの細胞ペアのために、図3に示すように測定された付着確率を平均し、接触時間に対してプロットされる。チャンバーの培地は、αのLのβ2の結合をアップレギュレートするために1mMのCa 2 +の各+およびMg 2 +二量体のE -セレクチン- Igのプラス1μg/mlのとHBSSいました。 、赤血球にICAM - 1 - Igを捕捉するための中間ステップは、ストレプトアビジンのインキュベーションステップの後に10μg/ml捕捉抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトFc抗体、eBioscience社）で赤血球をインキュベートするために追加されました。非特異的結合2つの異なる条件を制御するために使用されていました：1）赤血球は、抗ヒトFcを捕捉抗体を塗布し、ヒトIgGの代わりにICAM - 1 - Igは（O）と2でインキュベート）でコーティングされていない赤血球への結合好中球（Δ）抗体を捕捉。 10μg/mlヒトIgGは、Eの結合を最小限に抑えるために培地に添加した赤血球表面上に捕捉抗体の溶液中で-セレクチン- Igは。ヒトIgGの制御曲線として記録された非特異的結合は、特定の付着確率曲線を（得るために使用された
）を算出する。 2。式とのフィッティング特定の付着確率の曲線。 1（実線）は、効果的な結合親和性は 、K = 1.4•10 -4μm4 と k オフ = 0.3秒-1を返しました。
| 試薬 | MW（g /モル） | 濃度（mM）を | 量（g） |
|---|---|---|---|
| アデニン | 135.13 | 2 | 0.27 |
| D -グルコース（ブドウ糖） | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D -マンニトール | 182.17 | 55 | 10.02 |
| 塩化ナトリウム（NaCl） | 58.44 | 50 | 2.92 |
| リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム HPO ） | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L -グルタミン | 146.15 | 10 | 1.46 |
表1。EAS - 45バッファー調製（1L）。
| DMF 550μlの25 mgのビオチン- XHS | 0.1Mビオチン溶液 |
| 0.1ビオチンのw / DMFの10倍希釈 | 0.01Mビオチン溶液 |
| 0.1ビオチンのw / DMFの1:100希釈 | 0.001Mビオチン溶液 |
表2。ビオチン溶液の調製。
| ビオチンの最終濃度（μM） | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 赤血球ペレット株式（μL） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1X PBS（μL） | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| 0.1Mホウ酸緩衝液（液） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01Mビオチン溶液（μL） | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001Mビオチン溶液（μL） | 0.8 | 2 | 4 |
表3。赤血球のビオチン化。
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ディスカッション
首尾よく、いくつかの重要なステップを考慮する必要がありますマイクロ接着周波数アッセイを使用する。最初に、興味の受容体 - リガンドシステムのための特異的相互作用を記録することを確認してください。非特異的コントロールの測定値（図3参照、4）特異性を確認してください。理想的には、非特異的付着確率は、すべての接触の継続時間を0.05未満である必要がありますし、各時点の特定と非特異的付着確率の間に有意差を持っているため。別の方法は、赤血球の表面に結合するリガンドを使用することができる。それは、方法17をカップリング塩化クロム、ビオチン-ストレプトアビジンの結合より非特異的結合のより高いレベルを与えたことが示された。
第二に、特定の相互作用のための付着確率はミドルレンジにする必要があります。受容体は構成的に細胞上に発現している場合、この要件は、受容体とリガンド（または赤血球上のみリガンドの密度を変えることによって満たすことができるの変更が困難になっている密度）。この目的のために、未知の受容体 - リガンド結合親和性と新しいシステムをテストするとき、リガンド密度の様々なテ...
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この研究は、NIHの助成金R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343、およびR01GM096187によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ＃ | コメント |
| 10倍PBS | BioWhittaker | 17 - 517Q | 使用前に脱イオン水で1Xに希釈する |
| バキュテイナEDTA | BD | 366643 | 赤血球の分離 |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | シグマアルドリッチ | 10771 | 赤血球の分離 |
| アデニン | シグマアルドリッチ | A2786 | EAS - 45の準備 |
| D -グルコース（ブドウ糖） | シグマアルドリッチ | G7528 | EAS - 45の準備 |
| D -マンニトール | シグマアルドリッチ | 6360 | EAS - 45の準備 |
| 塩化ナトリウム（NaCl） | シグマアルドリッチ | S7653 | EAS - 45の準備 |
| リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム＆＃X2082; HPO₄） | フィッシャーサイエンティフィック | S374 | EAS - 45の準備 |
| L -グルタミン | シグマアルドリッチ | G5763 | EAS - 45の準備 |
| ビオチン- X - NHS | カルビオケム | 203188 | 赤血球のビオチン化 |
| ジメチルホルムアミド（DMF） | サーモサイエンティフィック | 20673 | 赤血球のビオチン化 |
| ホウ酸緩衝液（0.1M） | 電子顕微鏡学 | 11455〜90 | 赤血球のビオチン化 |
| ストレプトアビジン | サーモサイエンティフィック | 21125 | 官能配位子 |
| BSA | シグマアルドリッチ | A0336 | 官能配位子 |
| Quantibrite PEビーズ | BDバイオサイエンス | 340495 | 密度の定量化 |
| フローサイトメーター | BD Immunocytometryシステム | BD LSR II | 密度量子tification |
毛細管 0.7〜1.0ミリメートル× 30" | キンブルグラス株式会社 | 46485から1 | 引っ張りマイクロピペット |
| 鉱油 | フィッシャーサイエンティフィック | BP2629 - 1 | チャンバーアセンブリ |
| 顕微鏡のカバーガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 12から544 - G | チャンバーアセンブリ |
PEα-ヒトCD11a クローンHI 111 | ベイバイオサイエンス | 12-0119-71 | 図1のための試薬 |
| PE抗ヒトCD54 | ベイバイオサイエンス | 12から0549 | 図1のための試薬 |
| マウスIgG1アイソタイプコントロールPE | ベイバイオサイエンス | 12から4714 | 図1のための試薬 |
| 油圧マイクロマニピュレーター | ナリシゲ | MO - 303 | マイクロピペットシステム |
| メカニカルマニピュレータ | ニューポート | 461 - XYZ - M、SM - 13、DM - 13 | マイクロピペットシステム |
| 圧電変換器 | Physik Instrumente | P - 840 | マイクロピペットシステム |
| LabVIEWの | ナショナルインスツルメンツ | バージョン8.6 | マイクロピペットシステム |
| DAQボード | ナショナルインスツルメンツ | USB - 6008 | マイクロピペットシステム |
| 光学テーブル | 動力学システム | 5200シリーズ | マイクロピペットシステム |
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