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方法論記事

培養交感神経ニューロンの樹状成長を誘導する

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DOI:

10.3791/3546

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2012年3月21日

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, University of California, Davis

この記事について

サマリー

我々は選択的に周産期ラットの上頚神経節（SCG）から解離し、主交感神経ニューロンの樹状突起の成長を誘導する骨形成タンパク質-7（BMP-7）またはマトリゲルを使用するためのプロトコルについて説明します。

要約

樹アーバの形状は、ニューロン1-3受信し、これらの入力4-6の種類と分布に影響を与えることができ、合計シナプス入力を決定します。樹枝状成長と可塑性の変化のパターンは実験モデル7の障害神経行動機能に関連付けられていると、発達障害8-10と11-13の神経変性疾患の両方で観察された臨床症状に寄与すると考えられる。このような観測が正確に樹枝状形態を調節する機能の重要性を強調し、樹枝状成長を制御するメカニズムを識別する唯一の正常な発達の間に規制されてどのように神経接続の理解を進めるませんが、また、多様な神経疾患の新規治療戦略についての洞察を提供することを示唆している。

樹枝状成長機構の研究が大幅に可用性oによって促進されるであろうニューロンは実験的に、彼らは彼らのin vivoでの対応と同等の樹アーバを策定したものに樹状突起を拡張することはありませんている状態から切り替えることができるようになり、FAモデルのシステム。周産期のげっ歯類の上頚神経節（SCG）から解離交感神経ニューロンの初代培養は、このようなモデルを提供します。血清および神経節グリア細胞の不在下で定義された培地で培養したときに、交感神経ニューロンは軸索である単一のプロセスを拡張し、このユニポーラ状態は、培養14,15で数週間から数カ月持続します。しかし、培地への骨形成タンパク質-7のいずれかの追加（BMP-7）16,17またはマトリゲル18は樹状突起のために、形態学的生化学的および機能的な基準を満たす複数のプロセスを拡張するために、これらのニューロンをトリガーします。周産期のげっ歯類のSCGから解離し、定義された条件下で増殖交感神経ニューロンは、ニューロン19の均一な集団であるマトリゲル、BMP-7とデカペンタプレジック（DPP）と60A亜17,18,20,21の他のBMPの樹状突起促進活性に均一に対応すること。重要なのは、マトリゲルとBMPによって誘導される樹状突起の形成は、細胞の生存や軸索の成長17,18の変化の有無で発生します。

ここで、我々は、彼らがマトリゲルまたはBMPの選択的な樹状突起促進活性に応答するように周産期ラットのSCGから派生した交感神経の神経細胞の解離文化をセットアップする方法について説明します。

プロトコル

1。培地の調製（C2培地）

  1. 記載されている順序で、滅菌、使い捨ての500ミリリットルの三角フラスコに、次の行を追加します。
    量 コンポーネント 最終濃度
    190ミリリットル DMEM（低グルコース） N / A
    10ミリリットル脂肪酸フリーBSA（DMEMで20mg/ml） 50μg/ mlの
    2.8ミリリットル L-グルタミン 1.4 mmの
    4ミリリットルインスリン/トランスフェリン/セレン（100） 10μg/ mlのインスリン5.5μg/ mlのトランスフェリン38.7 nMのセレン
    0.4ミリリットル NGF（125μg/ ml）を 100 ng / mlの
    200ミリリットルハムF-12 N / A
  2. スワール優しくトン17×100無菌のスナップキャップチューブにチューブあたりOのミックスとアリコート10ミリリットル。
  3. -80℃で保存
  4. 重要な注意事項：
    • 使用直前にNGFを解凍します。
    • NGF原液を小分けする前に、プレコートは、タンパク質の組織培養プラスチック血清ピペットの内壁には、プラスチックにNGFの固着最小限に抑えることができます。最も簡単な方法は、BSAを複数回を含むDMEM混合物をピペットすることである。 DMEMの混合物でNGFチューブを数回すすいでください。
    • 遊離システインがインスリンのジスルフィド結合を不安定にする可能性があるため、最後のF-12を追加します。
    • CAPO 4結晶が形成することができるので、10ミリリットルを超えるボリュームで凍結させないでください
    • 2回以上C2培地を凍結融解しないでください。

2。カバーガラスの調製

  1. 私たちは、微細なドイツのカバーガラス（推奨ソースおよびカタログ番号については、表1を参照）は、このプロトコルでは一貫して働くことがわかった。
  2. ポリテトラフルオロエチレン（PTFEまたはテフロン）蓋ライナー（フィッシャーカタログ＃09-911-765）を300mlのガラス試料瓶に70％硝酸75〜100ミリリットルを追加します。
  3. 手袋を着用して、ドロップが硝酸溶液に一つずつカバースリップ。瓶の底にそれ以上の2から3以上のカバーガラスの厚さの層を作るために十分にカバースリップを追加します。
  4. 穏やかにそれ以上の185以上のRPMのオービタルシェーカーセットで、室温で6-8時間のためにカバーグラスで容器を振る。
  5. ヒュームフードで働いて、慎重に酸をデカントし、地域の規制に従って廃棄してください。コンテナに75〜100ミリリットルの水を追加し、超高純度組織培養グレードの水で一度カバーガラスを洗浄します。水が濁る場合カバースリップは、複数回リンスすることができます。優しくない以上185 rpmのオービタルシェーカーセットで、室温で一晩振とうする。
  6. 3日間の合計で毎日の硝酸/組織培養グレードの水の上にシーケンスを繰り返します。
  7. 最終的なデカント組織培養グレードの水とかろうじてカバースリップをカバーするのに十分なアセトンを追加します。
  8. このアセトンをデカンテーションし、適切に処分する。
  9. 150 mmのガラスシャーレにカバースリップを転送します。かろうじてカバースリップをカバーするのに十分なアセトンを追加します。カバースリップは、皿に単層であることを確認します。
  10. アセトンは、ヒュームフード内で一晩蒸発することができます。
  11. 滅菌1.5時間180℃で乾燥オーブンで焼くのカバー。

3。文化カバーガラスの調製

  1. 解剖前日は、無菌テクニックを使用して24ウェル組織培養プレートの各ウェルに1ガラスカバースリップを（上記のように調製）を追加します。各ウェルに滅菌ポリ-D-リジン溶液（0.5 Mトリス緩衝液、pH 8で100 mg / ml）を200μlを加え、4℃で一晩プレートを保管してください。
  2. 解剖の日、理想的に解剖を開始する前に、各ウェルからポリ-D-リジン溶液を吸引除去し、各ウェルを5回洗浄無菌組織培養グレードの水である。
  3. 37の各板や店舗℃のインキュベーターに200μlの低グルコースDMEMを追加します。めっきセルの前に約1時間、低グルコースDMEMを除去し、ウェルあたり250μlのC2培地を追加します。 37店のプレート°5％CO 2下C細胞は、めっきの準備が整うまで。

4。上頸神経節の郭清と分離

  1. 少ないグリア細胞が存在するため、交感神経の神経細胞の解離培養は通常、出生前から収穫の上頚神経節（SCG）（胚日19-21）仔ラットの解離によって調製される。ただし、この同じプロトコルは、出生後早期（1〜3日齢）のラット仔または周産期の仔マウスで正常に使用することができます。
  2. CO 2吸入による妊娠ラットを安楽死させる。腹部を剃ると、70％エタノールで皮膚を洗浄する。無菌条件下で子宮角を除去し、無菌の150ミリメートルのペトリ皿の中で子宮角に配置します。避ける解剖時のダムの腸や他の臓器を損傷することがあります。
  3. 胚仔を麻酔するために氷のパンの上に子犬をペトリ皿に置きます。子宮角および羊膜の自由胚を解剖する。子犬を安楽死させるために肩の下に正中線に沿って、各子犬の脊髄を切断します。これはまた、SCGの解剖時に頸動脈からの出血を減少させる大静脈を断絶。かつてペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した無菌のリーボビッツのL-15培地（または任意の空気緩衝培地）で、場所の胚を子宮角の解剖。
  4. Sylgardと150ミリメートルのペトリ皿半分満たされて彼らの背中に胚を配置します。滅菌20ゲージの針を使用して、胸部とSCGの解剖を容易に優しく首をhyperextending頭を、ピン。
  5. 顎下腺を明らかにするために鎖骨のレベルで首に沿って正中切開を行います。微細な鉗子を用いて腺を除去する（NO。 4またはno。 5デュモン）は、筋層を露出させる。
  6. 鎖骨の近くに胸鎖乳突筋を切るために微細な鉗子を使用しています。ゆっくり持ち上げて、気管の横の肩甲舌骨筋を切開。この筋肉が非常に薄いので、基本的な頸動脈とSCGを引き裂く回避するためにあまりにも深く切断は避けてください。これらの筋層が除去されると、頸動脈と迷走神経は明らかに見えるはずです。
  7. SCGはちょうど頸動脈の分岐の下に位置しています。微細な鉗子（4番または5番）を使用して、神経節を露出させる頸動脈の両側から組織を分析鈍らせる。 SCGなどSCG自体の上に横たわっている頸動脈のセクションを削除するには、それぞれ、ちょうど上記の頸動脈を把握し、SCGの吻側および尾側端の下に、2つの微細な鉗子を使用します。それは、開発のこの段階では、SCGの横にある節状神経節は、また、この段階で削除される可能性があります。結節神経節identifieすることができますその丸い形状と、そこから突出した大迷走神経によるD。これは、頸動脈の枝のいずれかに沿って位置しています。対照的に、SCGは形アーモンドされており、頸動脈の分岐部直下に位置しています。 L-15培地と抗生物質を含有する滅菌35mmの培養皿に解剖し、組織を配置します。次の手順に進む前にすべての子犬からSCGを削除します。
  8. 微細な鉗子を使用して、静かに内頸動脈と郭清（特に迷走神経と結節の神経節）中に削除され、他の組織からのSCGを分離します。神経節からカプセルを削除するには、微細な鉗子を使用しています。これにより、培養中の非神経細胞の数を減らすことができます。 L-15培地を含む別の滅菌35mmの皿に神経を転送します。
  9. SCGの関連付けを解除するには、L-15培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液2 mlのコラゲナーゼ（最終濃度1 mg / ml）を/ディスパーゼ（最終濃度5 mg / ml）と置き換えます。インキュベーション40分間37℃TE。
  10. 滅菌した15mlのコニカル遠心チューブにSCGを転送し、BSA（最終濃度1から2 mg / ml）とを添加したL-15で10 mlにボリュームを起動します。室温で5分間200×gで遠心します。上清を廃棄し、BSAを添加したL-15で複数回洗浄する。
  11. 回目の洗浄後、すべてのL-15を削除して、C2媒体の〜2mlに神経を再懸濁する。ファイアーポリッシュ曲がった先端ピペットを用いて細胞をひいて粉にする、ピペットはガラスへの細胞の付着最小限にするために粉砕前BSA/L15で被覆されていることを確認してください。穏やかに3-4回の粉薬。大きな塊が約1分のために解決し、15 mlのコニカルチューブに細胞懸濁液を転送してみましょう。残りのSCGにさらにC2メディアを追加し、粉薬。塊が沈降せた後、最初の粉砕後に収集されたその2番目の粉砕から細胞懸濁液を転送します。神経は主に解離されるまでこのプロセスを数回繰り返します。 D第四粉砕した後に残っている塊をiscard。
  12. 仔ラットの1リットル（通常は12から16匹）から解離した細胞については、追加のC2媒体を追加することによって、8〜10ミリリットルに細胞懸濁液中の培地の総量をもたらす。静かにピペットを用いて細胞を再懸濁し、細胞密度を決定するための小アリコートを削除します。 、ウェルあたりの細胞懸濁液のアリコートを250ミリリットル懸濁液中で細胞を維持しているし、文化の中で所望の細胞密度を2倍達成するために、細胞懸濁液の音量を調整します。樹枝状成長の形態学的研究のために、24ウェルプレートでの低密度で、我々は、通常、プレート細胞（ウェル当たり約5×10 4細胞）。
  13. 当研究室では、ガラスデシケータに直接ではなく、CO 2インキュベーター内で培養をSCG孵化。無血清培地で増殖させた交感神経ニューロンがわずかに高いCO 2濃度（約6.5％）とのより良い実行するため、我々はこれを行う。さらに、我々は、oで抗生物質を使用しないでくださいそれが神経突起伸長を阻害し、デシケータの文化を維持するため、URのメディアは、それが文化のサブセットで開発する場合の汚染の広がりを最小限に抑えるように思われる。このシステムを使用して、我々は定期的に最大8週間のSCGの文化を維持します。一度メッキ、SCG文化が底に滅菌水を含有するガラスデシケータの磁器デシケータープレート上に配置されています。 CO 2の約​​120ミリリットルは35.5℃であることはシャットシールとインキュベーターセットに全体のデシケーターを配置する前に、デシケーターに注入される

5。摂食と文化のメンテナンス

  1. 培養は、一般的に最初のメディア交換はメッキ後24時間以内に発生すると、週3回送られます。無菌ベントチップピペットを用いて、穏やかにウェルあたりのメディアの約半分を取り消すことができます。クリーンな無菌ベントチップピペットを用いて、新鮮なC2を除去し媒体のボリュームを交換してください。
  2. 培養物からの非神経細胞を除去するため、抗有糸分裂剤CYTosine-D-アラビノフラノシド（ARA-C、最終濃度が1から2μM）は、通常48時間以内の最初のメディア交換（例えば、メッキ後24時間）で培地に添加されています。 ARA-Cのこの濃度は、通常、すべての非神経細胞を除去するのに十分である。追加のARA-Cの治療が必要な場合は、これらは神経細胞への毒性を最小限に抑えるために、他のすべての給紙を行うことをお勧めします。

6。マトリゲルまたはBMP-7と樹枝状成長を誘導する

  1. 樹枝状成長を誘導するために、非神経細胞が排除された後、マトリゲルまたはBMP-7は、培養物に添加されており、培養物中のARA-Cレベルが大幅に削減されます。一般的に、我々はin vitroで 5日目に培地にマトリゲルまたはBMP-7を追加しますが、樹枝状成長は、in vitroで 、任意の時点で追加されたマトリゲルまたはBMP-7によって誘導することができます。マトリゲルまたはBMP-7は、C2培地に添加されており、上記のように文化が供給されます。
  2. マトリゲルとBMPによって誘導される樹枝状成長の時間ですと濃度依存性。最大効果のために、マトリゲルは、50から75μg/ mlの最終濃度でC2に追加されます。BMP-7は、50 ng / mlの最終濃度C2培地に添加されています。以上は100μg/ mlまたは100より大きいBMP-7の濃度マトリゲル濃度はng / mlの神経毒性を引き起こすことが指摘されている。樹状突起は（形態学的基準によって決定される）約48時間を最大限効果的な濃度マトリゲルまたはBMP-7への最初の暴露後に明らかになる。堅牢な樹状突起の成長を誘導するために、文化はBMP-7は、すべての摂食で媒体を含むが供給されています。同等の結果が同等の濃度の20,21でBMPの2、4、5と6を使用して取得されています。

7。 BMP-7誘発性樹状成長の免疫細胞化学的解析

  1. 樹状突起分枝の所望の程度が達成された場合、培養は0.1 Mリン酸緩衝液中4％パラホルムアルデヒドを使用して固定されています。最高の固定です。4％パラホルムアルデヒドでも半分の培地を交換して10〜15分にわたってこのステップを3-5回繰り返すことによってchieved。
  2. 15分 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で半分を4％パラホルムアルデヒドを交換し、10以上は、この手順を三回繰り返すことによって、文化をすすいでください。
  3. すべてのPBSを除去し、細胞を透過処理するために室温で5分間各ウェルにPBSにTriton X-100を200μlの0.1％を追加します。
  4. 吸引によってトリトン溶液を除去し、200μlのウェルあたりのブロッキング緩衝液（PBSで3-5％BSA、1％ヤギ血清を添加した）を追加します。室温で20-30分インキュベートします。
  5. ブロッキングバッファーを除去し、1:2000に希釈した一次抗体、微小管関連タンパク質2（MAP2）を追加 - ブロッキングバッファーで1:5000に。 4℃、室温または一晩℃で1時間培養をインキュベート
  6. 一次抗体溶液を除去し、室温で15分間にわたりPBSで三回文化を洗ってください。
  7. 暗所で室温で1-2時間の1％BSAを添加したPBSで希釈した二次抗体を用いて培養をインキュベートします。
  8. 二次抗体溶液を除去し、暗所に室温で10-15分間にわたってPBSで3回文化を洗う。
  9. ガラス基板上にマウントカバースリップは、二次抗体にタグ付け蛍光色素に適したpHでの水溶性封入剤のドロップでセル側を下にスライドします。封入剤は、乾燥させて一晩室温でスライドを保持します。 4℃店舗スライドイメージングまで、°C。
  10. スライドイメージを作成する前に室温に戻しすることができます。落射蛍光のために装備位相差顕微鏡を用いた蛍光画像を取得します。通常、単一ニューロンの樹状突起全体アーバーは20X客観的かつ適切なフィルタを使用してキャプチャすることができます。

8。代表的な結果

周産期のRAのSCGから解離交感神経ニューロンTSと血清および神経節グリア細胞の不在下で増殖はMAP2陽性のプロセス（図1）を拡張するために失敗するのではなく、一般的に、単一の軸索のプロセス14,15を拡張します 。 BMP-7（図1）、またはマトリゲルへの曝露は、樹状突起17,18の、形態学的生化学的および機能的な基準を満たす多数のプロセスの形成を誘導する。マトリゲルまたはBMP-7のいずれかの樹状突起促進活性は濃度および時間依存17,18,20です。最大の樹の成長はマトリゲルの濃度が50〜75μg/ mlのまたはng / mlの30〜100 BMP-7を用いて観察され、最大値の半分の効果は一般的に〜2 ng / mlのBMP-7の濃度で観察される。しかし、樹枝状成長の重要な変更は300 pg / mlでの低BMP-7の濃度で検出することができます。マトリゲルまたはBMP-7のいずれかに樹枝状の応答は<ニューロンの50％が樹状突起の-pのいずれかに曝露後24時間以内に2番目のプロセスを形成することで、比較的遅いエージェントをromoting。ただし、最初のBMP-7暴露後3日以内に、ほぼすべてのニューロンが最大限に効果的なマトリゲルまたはBMP-7の濃度に応答します。ニューロンごとの樹状突起の数は、治療の最初の10日の間に生じる変化のほとんどは、BMP-7への連続暴露で増加し続けている。 4週間後、BMP-7処理のニューロンは、通常、17の二次、三次も四樹の枝を示す6月8日主な樹状突起を持っています。樹あずまやの増加は、軸索の成長に大きな変化がない場合に発生し、同等の樹の応答は、BMPの2、4、5または6 20,21と同様の濃度を用いて誘発することができます。樹枝状成長が15,22内因性の神経節グリア細胞と共培養交感神経ニューロンによっても誘発することができますが、樹状応答は、これらの条件下で著しく遅くなります。

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図1。BMP-7は、培養交感神経ニューロンの樹状成長を促進する 。非神経細胞は、in vitroでの 2日目に48時間の開始のための抗有糸分裂で処理することにより、文化をSCGから排除されました。 in vitroで 5日目以降では、培養は50 ng / mlの（B）でBMP-7を添加した対照培地（）または培地のいずれかで処理した。 in vitroで11日目（BMP治療の5日後）に、文化はMAP2に対するモノクローナル抗体、樹状突起および神経細胞体で主に見られるタンパク質で免疫染色した。として代表的な蛍光顕微鏡写真に示すように、MAP-2陽性のプロセスの樹状突起（）の不足によって明らかなように、制御条件の下で成長したニューロンは樹状突起を欠く、とは対照的に、BMP-7（B）にさらされたニューロンは通常、複数のテーパーMAP-2陽性持っている樹状突起。

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ディスカッション

このモデルの利点は、（a）文化が他の細胞型17,23を欠いている交感神経の神経細胞の均一な集団で構成されていること、（b）交感神経ニューロンの成長因子の要件が十分に確立されている、の使用を許可する定義されているメディア、および定義された様々なメディア、および基板23を成長させ、交感神経ニューロンを維持するためにうまく機能し、（c）これらの培養物における神経細胞はマトリゲル、BMP-7とDPPの他のBMPの樹状突起促進活性に均一に対応し、 60A亜17,18,20,21、および（d）マトリゲルまたはBMP誘導樹状突起の形成は、細胞の生存や軸索の成長17,18の変化の有無で発生します。このモデルは、直ちに主dendr時には、樹状突起の形成に先行し、樹枝状成長、例えば、異なる段階でのニューロンの同期集団を得ることを可能にする樹枝状成長がトリガされたときの実験的な制御を可能にitogenesis（一次樹状突起の初期形成）と樹状成熟の後の段階。モデルの最も重要な制限は、RNAおよび生化学的研究を制限することができる単一のごみ、および遺伝子発現を操作するいくつか...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作品は、国立衛生研究所（助成金R21 NS45037とR01 ES014901）からの資金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
カバーガラス Bellco 1943から10012 12ミリメートルラウンドカバースリップ第1位の厚さ、ドイツのガラス
曲がった先端ピペット Bellco 1273から50003
ポリ-D-リジンシグマ P0899-100MG ストック溶液1 mg / mlの
蒸留水ギブコ 15230
ファイン鉗子デュモンない。 4と5 ファイン科学ツール（FST） 11252から30 11241から30
20ゲージの針ベクトン·ディッキンソン 305176
リーボビッツのL-15培地インビトロジェン 11415
コラゲナーゼワージントン 4176 1 mg / mlの
ディスパーゼロシュ社 04942078001 5 mg / mlの
ハンクス平衡塩溶液（-CA-Mg）のインビトロジェン 14185-052
DMEM低グルコースインビトロジェン 11885
L-グルタミンインビトロジェン 25030 20mMの
インスリン/トランスフェリン/セレンインビトロジェン 51500-056 100X
脂肪酸フリーBSA カルビオケム 126609
NGF ハーランのバイオ製品 5017
ハムF-12栄養培地（F-12） インビトロジェン 11765
シトシンアラビノシドシグマ C1768
マトリゲル BDバイオサイエンス 356234 凍結融解の繰り返しを避ける
BMP-7 R＆DシステムズCuris株式会社 345-BP BMP7-07H BMPは4、5、6の作業同様に同様にBMP-7、商業的に入手することも容易である
パラホルムアルデヒドシグマ P6148
トリトンX-100 フィッシャー BP151-500
マウス抗ラットMAP2抗体スタンバーグモノクローナル抗体（株） SMI52 5000分の1
のAlexa Fluor®546ヤギ抗マウスインビトロジェン A11003 10000分の1
マウントメディア退色防止キット分子プローブを延長 P7481

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