齧歯類のために全体の動物灌流固定

Summary

ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには：ここでは、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。

Abstract

固定の目的は、急速にかつ均一に生きているような状態で組織を維持することです。固定は、同じレート^5,7で組織のすべての領域に到達しないため組織の小さな断片は、無傷の脳の浸漬固定のために問題を引き起こすような大きな試料でも固定の作品に直接組織を配置しながら。組織が ​​保存される前に、多くの場合、低酸素への応答の変化は^、12を開始^します 。直接循環系を介して固定液を灌流することの利点は、化学物質がすぐに自然な血管網を用いた生物の隅々に到達することができるということです。最も効果的に循環系を利用するためには、注意が生理的な圧力を³と一致するように注意する必要があります。生理的な圧力が使用される種に依存していることに注意することが重要です。灌流固定するためのテクニックは、固定される組織によって異なり、どのように組織は、次の固定を処理されます。このビデオでラットの心臓を免疫組織化学のための脳の最良の保全を得るために：我々は、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。この技術の主な利点（対重力給電システム）は、循環器系が最も有効に活用されていることです。

Protocol

1。固定液を準備する

（テーブルの固定液とバッファを参照してください。）

2。灌流バッファを準備します。

（テーブルの固定液とバッファを参照してください。）

3。装置および麻酔を準備します。

1. 37水浴、暖かい血バッファを使用し℃、バッファーを満たしたビーカー中で出口弁を配置します。バッファー50 mlシリンジを記入し、固定チューブに接続します。バッファを追放し、撤退によって繰り返しチューブをフラッシュします。
2. チューブ内のすべての気泡が除去されるまで、バッファの行をクリアします。それは、行のいずれかに気泡を持っていないように血流の成功のために重要である。
3. シリンジを取り外し、4％パラホルムアルデヒド固定（室温）容器を接続します。容器にチューブを配置しながら、チューブ端で空気の泡を避けるために、チューブを絞るように、エンドトンからバッファ突出のドロップ容器内の液体表面に接触O。
4. 出口ポート（ニードルの端）を閉じます。固定バルブ（白）と同じ位置にバッファーバルブ（青）を回します。これは、バッファラインからの流れをできるようになります。
5. 出口ポートを開くとバッファラインを充填するためのA3 A1からステップを繰り返します。すべての気泡がチューブに気泡を導入しないように注意しながら、注射器を削除し、バッファー容器を接続し、出口ポートを閉じて排除された後。
6. ゴム製の圧力計のブラブをポンプで圧力を保持する能力のためのシステムをテストします。システム内の空気の圧縮性に起因するいくつかの抵抗が通常あります。
7. アクセスの容易なために、手術ツールをセットアップします。気泡の可能性を排除するために緩衝液を灌流針を記入してください。
8. 手術前に、キシラジン/ケタミン混合物（最大80 mg / kg体重のケタミンおよび10 mg / kg体重のキシラジン）腹腔内注射（27ゲージ針と1ccの注射器）を介して投与され。麻酔薬の追加投与は、麻酔の外科的平面を維持するために、各操作の過程で必要に応じて実行されます。

4。血流外科

1. 動物が麻酔の外科的平面に達すると、砕いた氷で満たされた浅いトレイの上に置きます。 （麻酔の深さを決定するためにつま先ピンチ応答メソッドを使用します。続行する前に動物が応答しなければなりません）。
2. ちょうど肋骨の下の外皮と腹壁を介して5〜6センチメートル横切開を行います。横隔膜から肝臓を慎重に分離します。
3. 湾曲した、鈍いはさみを使って横隔膜に小切開を行います。指の位置と圧力がダイアフラムを削減するための能力を支援することができます。
4. 胸膜腔を公開するために肋骨の全長に沿って横隔膜切開を続行します。
5. 注意深く肺を変位、肋骨の片側に沿って湾曲した、鈍いはさみを配置し、cuを作るアップ鎖骨に肋骨を介してT。反対側も同様のカットを行います。
6. 離れて胸骨を持ち上げ、慎重に心臓に接続する任意の組織をトリミングします。止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。正常に完了したら、胸腺は、主要な血管の明確なビューを提供し、胸骨と一緒に中心から離れて持ち上げる。
7. アイリスのはさみを使用して左心室の後端に小さな切開を行います。

拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

8. 上行大動脈にカット心室を通して15ゲージ平滑末端またはオリーブ先端灌流針を渡します。先端が大動脈の壁を通して見えるようにする必要があり、上腕動脈と頸動脈動脈が分岐する大動脈弓に到達してはいけません。
9. 心をクランプするために止血剤を使用して、これは、針を固定し、漏出を防ぐことができます。必要に応じて、変更された止血剤（これらのhemostatsは解剖が始まるまでの場所に残りますが、明確にするために、将来のイラストから省略されています）針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。
10. 最後に、下行大動脈を損傷することなくできるだけ大きな口を作成するにはアイリスのはさみを使って動物の右心房に切開を行います。この時点で、動物は灌流する準備ができました。

5。かん流

1. 気泡を導入しないように注意しながら針をベースに、出口ポートを開いて、添付してください。
2. 迅速＆均等に80ミリメートルHgの圧力に圧力計の電球を上げる。バッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。タイマーを開始します。
3. 針の角度を調整します。針の角度は最大流量（角度調整付流量の変化に注意してください）​​の達成に重要である。
4. バフを切り替えるERバルブ（青色）バッファがほぼ完成された後（200ミリリットル）。流体は、明確な実行する必要があります。肝臓のクリアは良い灌流の指標である。肝臓はこの時点で明確にする必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。
5. 固定の震えは、数秒以内に観察する必要があり、これは固定の真の時間を考慮する必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。
6. 圧力は徐々に安定した流量を維持するために130ミリメートルHgの²の最大値まで増加することができます。
7. 固定がほぼ終了した後、出口バルブを閉じます。あなたの記録の終了時間を示します。
8. ラットは、この段階では硬い必要があります。
9. 使用されるホルムアルデヒドは、あなたの機関の規制に従って廃棄を収集し、保管する必要があります。

6。解剖^4,11

1. はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。
2. 首から鼻まで外皮に沿って正中切開を行い、公開頭蓋骨。
3. 頭蓋底が露出されるように残っている首の筋肉を切り落とす、はさみまたはrongeursを使用して、任意の残留筋肉を削除します。
4. 慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせ、一方の側に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い端に配置します。
5. 次に、後頭蓋表面の遠位端まで延びる切断してください。反対側で同じカットを行います。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。
6. 先端は、脳への損傷を防ぐために切断されるブレードを持ち上げ、背側遠位後方隅から頭蓋骨の先端の正面の端に移動するよう慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。反対側に対して、この手順を繰り返します。
7. 脳から離れて、頭蓋骨の背面皮rongeursを使用します。同様rongeursを使用して、頭蓋骨の両側を切り落とす。
8. スパチュラを用いて、嗅球と神経接続を切断脳の腹側表面に沿ってtions。
9. 優しく、まだアイリスはさみを使って頭蓋骨に脳を接続し、任意の硬膜をトリミング、離れて頭から脳をいじめる。
10. 脳を除去し、固定液を含有する流体脳自体の体積の少なくとも10倍のバイアルに入れてください。バイアル時折渦。

7。ポスト固定＆ストレージ

1. 時折渦巻く、4°Cで24時間固定の脳を保つ。
2. 24時間後、培地を3回交換し、それぞれの時間を渦巻くことによりリン酸緩衝化生理食塩と脳を洗ってください。
3. 脳は、その後リン酸塩に格納することができますアジ化ナトリウムを含む生理食塩水またはHBHSバッファと4℃に保った

8。代表的な結果

灌流の成功の最初の指標は、鼻など四肢、耳、足など胸腺および肝臓（IHCワールド）などの内部器官のクリアです。脳の肉眼検査は、血液（淡黄色の外観に白）の血管voidを明らかにする。これは、染色と免疫組織化学のために運命づける組織切片内でもtrueになります。灌流の結果の最終的な指標は、組織内の微細構造の状態である^。1,6,7,8

固定液の準備：

8％のパラホルムアルデヒドの在庫を準備します。

500ミリリットルのdH 2 Oに40グラムのパラホルムアルデヒドを追加します。 60〜ソリューションを加熱 - 65°C（65を超えないようにしてください°C、そう悪影響を免疫組織化学的手順の成功に影響を与える可能性）を攪拌しながら。 ソリューションをクリアするには、熱を削減し、スポイトで1.0 M NaOHを2〜3 mlを加える。 フィルタと最大1ヶ月から4℃で保存。

0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4を準備します。

リン酸ナトリウム一塩基の在庫については、1 LのdH 2 Oに27.8グラムのNaH 2 PO 4 * H 2 Oを追加する リン酸ナトリウム二塩基株式については、1 LのdH 2 Oに28.4グラムのNa 2 HPO 4を追加 塩基株式の190ミリリットルに一塩基株式の810ミリリットルを追加します。

4％パラホルムアルデヒド固定液を準備します。

0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液に等量の8％パラホルムアルデヒドの在庫を追加します。 注：この修正は最高のは、事前に72時間以上のものを新たに調製されていません。

灌流およびストレージバッファを準備します。

リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4のバッファの準備

1 LのdH 2 O 9グラムのNaCl 144 mgのKH 2 PO <サブ> 4 795ミリグラムのNa 2 HPO 4 pHをチェックする

HEPESは、アジ化ナトリウムpH7.4でハンクス液（HBHS）をバッファ

990ミリリットルのdH 2 O 7.5グラムのNaCl、 0.3グラムのKCl 0.06グラムのKH 2 PO 4 0.13グラムのNa 2 HPO 4 2グラムのブドウ糖/グルコース 2.4グラム10ミリメートルのHepes 0.1グラムのMgCl 2 6部のdH 2 O 0.05グラムのMgSO 4 7部のdH 2 O 0.165グラムのCaCl 2 2部のdH 2 O 90mgのNaN 3を pHをチェックする

表1固定液とバッファーの調製。

図1。

図2：灌流装置I.の準備は固定行で開始します。気泡のチューブをフラッシュし、急速に注射器にし、ラインを介してバッファを追放し、撤退することで、バッファに記入してください。針側のバルブを遮断してください。気泡を導入することなく、固定瓶に固定行を置きます。

図3：灌流装置IIの調製。 1。針の端にバルブを開きます。 2。フローに配置するバッファバルブ（青）を回します。 3。気泡のチューブをフラッシュし、急速に追放し、シリンジでバッファを引き出すことによってバッファを使用して記入してください。 4。針の端にあるバルブを閉じます。バッファのボトルにチューブを置きます。システムが正しい密封されていることを確認する試験圧力圧力計の電球を汲み上げ、ゲージを見ながらLY。装置は、現在灌流手続きの準備ができています。

図4バッファの配信のための位置に灌流装置。

図5潅流手術I.）は、外皮と腹壁を介して横方向の切開を行います。 b）の横隔膜の切開を行い、心臓を露出させる横隔膜を横切る。アップ鎖骨にリブの両側に平行にカットします。 c）の止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。

図6。灌流手術II。 1）上行大動脈にカット心室を通して灌流針を渡します。 b）に固定灌流針が心臓をクランプするhemostatsのいずれかのセットを使用します。変更された止血剤の2番目のセットはまた、漏れを防止するために針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。アイリスのはさみを使用すると、左心室の後端に小さな切開を行います。

図7。ライン内の圧力を作成するためのバッファポンプ圧力計の電球と灌流。バルブ（1）を開くと、針ハブに接続します。それは空気の泡が導入されていないことを確認することが重要です。 80ミリメートルHgの圧力に圧力計バルブをポンプおよびバッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。

図8。固定液で灌流バッファがほぼ完成されるとは（200ミリリットル）が流れるように固定を可能にするためにバッファバルブ（1）を切り替えます。圧力は徐々にまで増加することができます130ミリメートルHgの最大値。

図9。解剖I.）は、はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 b）の首から鼻まで正中線に沿って皮膚切開を行い、頭蓋骨を公開します。頭蓋底が露出されるように、c）の残りの首の筋肉を切り落とす。頭蓋表面の大開口部（大後頭孔）がアクセスできるように頭部を保持します。慎重に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い先端を挿入し、切断してください。反対側に同じ操作を繰り返します。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。

図10。解剖II。 1）慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。あなたは脳への損傷を防ぐために切断される先端を持ち上げます。のために同じことを繰り返す反対側。脳から離れ頭蓋骨皮rongeursを使用しています。 b）の頭蓋骨のイラストは削除され、脳が露出した。 c）の脳の最も前方の位置に嗅球神経接続を切断するヘラを使用しています。慎重に削除を容易にするために接続を切断するための脳の下面に沿ってヘラの先端をガイドします。脳を除去し、固定液のバイアルに入れてください。

Discussion

手術の成功のために追加のメモ：

1. ダイアフラムが破られると、低酸素症および高炭酸ガス血症は、その後の分析を混乱させることが不可逆的生理的変化を開始するとして急速に先行する。
2. 針を挿入し、所定の位置に固定されている場合、残圧は、ニードル（フラッシュバック）のベースに血液をプッシュします。実際には、大きな動物が精力的に血液を除名することができます。それは、血液が少なくとも灌流を完了するには、障害物を提示する気泡を導入することを避けるために針の根元に到達することが重要です。ない血液が針の基地で観測されていない場合は、灌流リグの出口ポートに接続することによってバッファを使用して針と詰め替えを削除します。バッファがチップを介して実行されると、針が心臓に再挿入することができます。
3. 大動脈内針の適切な配置が重要である、それは限り大動脈弓として到達してはいけません。
4. 複数perfusionsが行われている場合、それはトン必要はありません。毎回最初からoがセットアップ。ユーザは、各ボトル（200mls動物/溶液）内のバッファと固定の両方に適切なボリュームを持っている必要があります。必要に応じてボトルも補充することができます。考慮すべき最も重要な側面は、動物へのセットアップ（出力バルブ）から実行される灌流ラインをフラッシュしています。灌流終了後、この行は、その中に4％パラホルムアルデヒドを持っています。バッファボトルからチューブを外し、固定を洗い流すために水を満たした50 mlの注射器を使用しています。出口弁はホルムアルデヒドの適切な処分のための廃棄物収集ビーカーに入れていることを確認します。この3回繰り返します。 2.3に示すように、同じメソッドを使用してバッファを補給。
5. 固定のためにこの方法では、実験の要件に応じてバッファと固定その他の固定剤（例えば、EMに使用されるものなど）の両方を変更する能力を持つ高度に適応可能である。
6. このシステムは、頻繁に生きている組織の抽出に使用されています。このためにプロセス1は、単にバッファの配信を使用するだけ（まだ全体のシステムに接続されている間にバッファーボトルをアイスバケットに配置され、固定ボトルが空ではなく密閉型として設定されています）。これは、最適な圧力で冷緩衝液灌流を保証します。ここからシステムがいずれか（量が問題にならない場合は）バッファに直接染料を追加したり、バッファ/バッファの間に染料溶液の最小限の量で注射器を使用することにより修正可能な染料の注入に適合させることができます - 固定ステップ。
7. 血管の鋳造の場合には、圧力監視バッファのステップは、50ミリリットル注射器のいずれかが（チューブ、バルブ、保持装置への直接配信や使い捨て二アタッチメントを使用する必要がありますしかし、粘度、鋳造ソリューションの本質を固めるために不可欠である現在のシステムとのインタフェースに加えられたコンテナ）を使用することができます。我々の研究室 "血管のキャストは灌流装置の設計と製造を先行していた。したがって、我々は、stできません。圧力測定は、配信サイトで正確な測定であることを食べました。数字は、粘性流体の配信が成功を達成するために調整する必要があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
機器	会社	カタログ番号	コメント
			麻酔：
ケタミン/キシラジン混合物（麻酔が研究室/機関ごとに異なる​​場合があります）	Ketaset	NDC 0856-2013-01	10 mLのバイアル
			手術：
針の先端、27 GA×1.25 "	資材·サービス	25251
大鈍/鈍湾曲したハサミ（〜14.5センチメートル）	ファイン科学ツール	14519から14
ストレートアイリスはさみ	ファイン科学ツール	14058から11
標準ピンセット	ファイン科学ツール	11027から12
ファイン（グレーフェ）ピンセット	ファイン科学ツール	11050から10
1つの大きな止血鉗子 - 曲線または直線（〜19センチ）	surgicaltools.com	17.21.51
2標準止血鉗子 - ストレートセレーション（14センチ）	ファイン科学ツール	13013から14
1変更された止血剤（チップを介して提出し、15ゲージ穴付）	ファイン科学ツール	13013から14
15ゲージの鈍またはオリーブ先端が針（灌流針）	Fisnar	5601137
			灌流 ：
HyPerfusionシステムまたは同等の
リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4の緩衝
0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中4％パラホルムアルデヒド
浅いガラスまたはプラスチックトレイ、約10 "×10"
クラッシュアイス
水浴（37℃）
タイマー
50mlの注射器	MEDLINE産業	NPMJD50LZ
			解剖 ：
パ標準的な鋭い/鈍いストレートはさみのIR（〜12センチ）	ファイン科学ツール	14054から13
培地曲線または直線rongeurs（14-16 cm）または頭蓋骨除去ペンチ	ファイン科学ツール	16020から14
ストレートアイリスはさみ（〜9センチ）	ファイン科学ツール	14058から11
マイクロスパチュラ（ダブル2 "フラット終了すると、1を丸め、円すい1〜1/8"）	ファイン科学ツール	10091から12
			ポスト·ボール＆ストレージ：
50 mlのガラスバイアル
アジ化ナトリウム（90mg / l）を40ミリリットルHEPES緩衝ハンクス溶液（HBHS）