我々は、セットアップする方法を示しています in vitroで虚血/再灌流モデルとどのように虚血後の心筋細胞の幹細胞治療の効果を評価する。
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この記事について
サマリー
要約
幹細胞移植のプロトコルは、臨床実践1,2,3への道を模索しています。 、より良い結果を得るためのプロトコルは、より堅牢な作り、そして埋め込 み型細胞の新しい源を見つけることは4,5最近の研究の焦点です。細胞治療の有効性を調査することは容易ではないとの新しいツールは、処理工程6に関与するメカニズムを調査するために必要とされる。我々は、虚血/再灌流傷害時に、幹細胞移植後の携帯電話接続、さらには細胞内メカニズムの観察を可能にすると細胞療法の有効性を評価するために、虚血/再灌流の実験的なプロトコルを設計した。 H9c2 cardiomyoblast細胞は、細胞培養プレート7,8の上に置かれた。虚血は0.5％以下の酸素レベルとグルコースを含まない培地で150分でシミュレートされました。その後、通常のメディアと酸素レベルは、再灌流をシミュレートするために再導入されました。酸素グルコース欠乏後に、損傷した細胞を培養するためにそれらを追加することにより、間葉系幹細胞由来の標識されたヒトの骨髄の移植で治療された。彼らは簡単に拡張および自家、最小侵襲手術で簡単にアクセス可能であるため、間葉系幹細胞が臨床試験で好ましい。共培養の24時間後、細胞は生細胞と死細胞を区別するためカルセインとエチ-ホモ二量体で染色した。このセットアップでは、私たちは共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞間の接続を調査し、フローサイトメトリーによる虚血後の細胞の生存率を定量化することができました。共焦点顕微鏡は、細胞融合と細胞間のナノチューブの形成などの2つの細胞集団の相互作用を示した。フローサイトメトリー分析は、グラフ上にプロットし、統計的に分析することができる損傷した細胞の3つのクラスタを明らかにした。これらの集団が別々に調べることができると結論は、シミュレートの有効性にこれらのデータを描画することができます治療的アプローチ。
プロトコル
1。 H9c2 cardiomyoblast細胞の準備
H9c2ラットcardiomyoblastsは、ATCC（ヴェーゼル、ドイツ）から入手し、高グルコース（4.5 g / L）のDMEM、10％ウシ胎児血清、4mMのL -グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むで増殖させた。 H9c2筋芽細胞株は、ラット胚の心臓に由来する、それが骨格と心筋8,9の両方のin vitroモデルとして使用されます。
H9c2細胞の12ウェルプレートを準備します。
- H9c2細胞のペトリ皿から培地を削除します。
- 2〜3ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを5mlのPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。
- 37℃インキュベーター内で5分間、ペトリ皿を置きます。
- 10ミリリットルのDMEM培地とトリプシンを阻害する。
- 8分間1200rpmで細胞をスピンダウン。
- 1ミリリットルDMEM培地とトリパンブルー染色を用いて血球計算板でカウント細胞上清、再懸濁し、細胞を除去した後。
- 12ウェルプレートにウェル当たり2ミリリットルDMEMでシード3万H9c2細胞を。
- 24時間37℃のCO 2....
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ディスカッション
実証プロトコルはそのようなモデルのすべての利点と欠点と心筋梗塞の幹細胞治療、のはるかに複雑な問題へのin vitroでのアプローチになります。もちろん、それが心筋梗塞の間と後に起きている複雑な（例えば、免疫学）のイベントを反映することはできませんが、虚血後の細胞で追加された細胞の直接的な効果に焦点を当てることができます。 H9c2 cardiomyoblasts上でシミュレートされた虚血の影響は非常に使用される細胞の継代の数とO 2濃度で、OGDの時間に依存する。一つは、正確にこれらのパラメータを調整し、標準化されたプロトコルを持つために、特定の細胞型に最適な条件を見つける必要があります。その後、プロトコルは、誘導多能性幹細胞や成体幹細胞は、そのような胚性幹細胞など、さまざまな追加の細胞型の効果を調べるために多くの方法（腎、肝または脳虚血/再灌流11,12,13,14）で使用することができます。 15、E馴化培地を16または様々な前処理を17,18または関心の焦点に任意のパラメータのffectiveness。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、OTKA（ハンガリー科学研究費）D45933、T049621、TET（ハンガリー科学技術振興財団）A4/04、Arg-17/2006とSIN、Bolyai、ÖvegesのフェローシップとTÁMOPによってサポートされていました4.2.2-08 / 1 / KMR - 2008 - 0004および4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001。 OTKA 83803。我々は、Voice overを提供するためにウィリアムのGesztesに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| カルセイン- AM | 分子プローブ | L3224、C3099 | http://www.invitrogen.com |
| エチジウムホモ二量体A - 2 | 分子プローブ | L3224、E3599 | http://www.invitrogen.com |
| Vybrantは、DID | 分子プローブ | V22887 | http://www.invitrogen.com |
表1。試薬。
| 機器の名前 | 会社 | コメント（省略可能） |
|---|---|---|
| ツァイス顕微鏡用PeCon細胞培養システム | PeCon社 | www.pecon.biz/ |
表2。機器。
参考文献
- Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research.
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再版と許可
