我々は、GFPトランスジェニックマラリア原虫を用いて脾臓の生体顕微鏡検査を実施するための方法およびこの器官内の寄生虫のモビリティと血流の定量化を示す。
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方法論記事
脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流の定量的解析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
実験的なげっ歯類のマラリアモデルにおける生体顕微鏡の出現は、寄生虫-宿主相互作用の1,2の知見に大きな進歩を可能にした。このように、前赤血球段階でマラリア原虫のin vivoイメージングで皮膚のリンパ節3、皮膚の4の寄生虫の完全な開発、および移行を確保するために、肝細胞由来のmerosomeの形成に寄生虫のアクティブな入り口を明らかにしたと血流5にメロゾイト放出。また、赤血球内の個々の寄生虫の開発は、最近の4Dイメージングを使用して文書化し、マラリア6のタンパク質輸送上の私たちの現在のビューに挑戦されています。従って、生体内イメージングは根本的にマラリア原虫の開発における重要なイベントに関する我々の見解を変更しました。残念なことに、脾臓、主要なリンパ器官を通じて、マラリア原虫のダイナミックなパッセージの研究は、絶妙に感染した赤のBをクリアするように適応lood細胞は、技術的な制約のために不足している。
Balb / cマウスにおけるマラリア原虫yoeliiのマウスモデルを用いて、我々は、脾臓の生体内イメージングを実施し、中に赤い果肉の繊維芽細胞由来の障壁の細胞にそれと寄生された赤血球の付着（pRBCs）の差動リモデリングを報告している非致死的な寄生虫ラインP.yoelii 17倍の感染は、P.yoelii 17XL致死寄生虫の7行目で感染することに反対した。これらの結論に到達するには、ImageJのフリーソフトを使用して、特定の方法論は、シングルpRBCsの高速三次元運動の特性評価を可能にするために開発されました。このプロトコルを用いて得られた結果は、脾臓の寄生虫の速度、方向性と滞留時間を決定する生体内での遵守に取り組むすべてのパラメータを許可する。さらに、我々は、血流の生体顕微鏡を用いて定量化し、差を使用するための方法論を報告する脾臓の複雑な微小構造への洞察を得るためにferent着色剤。
倫理の文
すべての動物実験は、バルセロナCEEA - UB（：5429プロトコルなしDMAH）の大学の動物実験のために倫理委員会で承認されたガイドラインとプロトコルに準拠して、バルセロナ大学の動物施設で実施した。年齢の6-8週の雌BALB / cマウスはチャールズリバー研究所から入手した。
プロトコル
このメソッドは、7に報告された研究で使用されていました。
1。緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子組換え寄生虫を持つ動物の感染症
- 戦略およびプロトコルをターゲットP. 17XLと17倍のyoelii - GFPトランスジェニックラインが同じベクトルを使用して生成されたが、P.のため別の場所で説明berghei 8。彼らは、P.のユビキタスプロモーター下にGFP 9の変異体3バリアントを表現全体の内の赤血球の発達サイクルの間に細胞質ゾルの寄生虫GFPの構成的発現を指示するberghei伸長因子1（Pbeef1a）、。
- P.の寄生された赤血球（pRBCs）を動物の腹腔内に注入する5〜10％の寄生虫血でドナーマウスの尾の血液から得られるとPBSで希釈したyoelii - GFPトランスジェニック系統17XLと17倍。 3日後infectiで1％の周辺寄生虫に到達するための5 × 5 pRBCs /マウスの用量を使用して、（π）上。
- 3日目πで、両方の寄生虫の線に感染したマウスのその寄生虫をチェック100倍油浸対物と光顕微鏡下でギムザ染色と観察が続くテール滴の血液で血液塗抹を行うこ....
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ディスカッション
このげっ歯類のマラリアモデルにおける脾臓の生体顕微鏡検査の実装は、これまで技術的な考慮事項に"ブラックボックス"が原因と考えられているこの器官を通じて寄生虫の動的な経過を調査の可能性を開いた。ここでは、主要な努力は、単一および人口のレベルで異なる寄生虫の行の比較分析を可能にする定量的手法を適応する置かれた。マラリア3,5の前にイメージングされていた他の組織や細胞とは対照的に、イメージング脾臓を通じてpRBCsの通過が考慮臓器の三次元性と区分を取る必要がある、高速および低速の異なる循環の存在フラックス13と同様に急速な赤血球速度。この目的で、オンラインで利用可能なImageJのソフトウェアを使用して、特定の方法論はpopulatioで線間の単一の寄生虫のトラッキング、モビリティの分析と比較を可能にするために開発されたn個のレベル。しかし、このコンテキストで単一の寄生虫の同定と追跡を解決する自動ソフトウェアのアプリケーションはまだ必要です。注目すべきは、寄生虫のモビリティを記述するために使用されるパラメータは、以前はリンパ球動員およびin vivoで
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
私たちはA.ボッシュ（コンフォーカルユニット、CCIT - UB、IDIBAPS）に、GFPトランスジェニック原虫の寄付のためにJ.バーンズに、マラリア原虫の生体顕微鏡で初期訓練と継続的な入力のためのS. GraeweとV. Heusslerに特に感謝しています画像解析と技術支援のための定量化とP. Astolaへの支援のための。我々は、R.のトウスとビデオ制作のためのI.のCaraltに感謝。 MFは、カタルーニャの一般性から大学院生フェローシップの受賞者です。 HAPはICREAの研究教授である。 HAPの実験室での作業は、民間財団セレックス（カタルーニャ、スペイン）により、科学とイノベーションのスペイン省が、補助金協定Nの下で欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）° 242095によって資金を供給される（ SAF2009 - 07760）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| ライカTCS - SP5共焦点顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ、ハイデルベルク、ドイツ | TCS - SP5シリアル番号。 5100000419 | |
| ケタミン（Ketolar 50 mg / ml）を | ファイザー | 631028 | |
| ミダゾラムの15 mg / 3ミリリットル | Normon | 838193 | |
| テキサスレッドコンジュゲートさ7万MWデキストラン、 | 分子プローブ | D1830 | |
| フルオレセインイソチオシアネート、異性体I（FITC） | シグマ | F7250 | |
| ヘキスト33342 | シグマ | H1399 | |
| ギムザ染色 | シグマ | GS1 | ワーキングソリューションは、蒸留水で10％です。 |
| スーパー接着剤- 3ロックタイト | ロックタイト | 9975-0880 |
参考文献
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
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再版と許可
