幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

サマリー

現在の幹細胞治療の主要なハードルは、ホスト組織にこれらの細胞を提供するための最も効果的な方法を決定しています。ここでは、その多能性を維持するために、脂肪由来幹細胞を可能にしながら、アプローチの効率的かつ単純であるキトサンベースの配信方法について説明します。

要約

多能性幹細胞は再生医療^1-3の分野で非常に有用であることが示されている。しかし、組織再生に効果的にこれらの細胞を使用するためには、変数の数を考慮する必要があります。これらの変数が含まれます：総体積と移植部位の表面積、組織の機械的性質および血管新生の量と細胞外マトリックスのコンポーネントが含まれています。組織の微小環境を、。宿主組織を模倣した機械的強度を維持しながら、したがって、これらの細胞を提供するために使用される材料は、定義された化学組成を持つ生体適合性でなければなりません。これらの材料はまた、酸素と栄養細胞が付着し、増殖するための有利な微小環境を提供するために透過性でなければなりません。キトサン、優れた生体適合性を有するカチオン性多糖類は、容易に化学的に修飾されたおよび in vivo Mac でと結合する高親和性を持つことができますromolecules ^4-5。キトサンは、細胞接着、遊走および増殖のための基質として機能できるように、細胞外マトリックスのグリコサミノグリカン部分を模倣しています。本研究では、三次元足場⁶ベースのコラーゲンに脂肪由来幹細胞（ASC）を提供するミクロスフェアの形でキトサンを利用しています。理想的な細胞へのミクロス比はインキュベーション時間とロードすることができましたセルの最大数を達成するために、細胞密度を基準にして決定した。 ASCは、キトサンマイクロスフェア（CSM）に播種されると、それらはコラーゲン足場に埋め込まれており、長期間の培養で維持することができます。要約すると、この研究では、正確に三次元生体材料足場内で幹細胞を提供するメソッドを提供します。

プロトコル

1。の単離脂肪由来幹細胞（ASC）

注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

1. ラット腎周囲および副睾丸脂肪を分離し、前述の^6、1％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌ハンクス緩衝塩溶液（HBSS）で洗浄する。
2. 組織をミンチし、室温で8分間500グラムで50 mLのチューブと遠心分離機に1％FBSを含むHBSS 25 mLに1〜2グラムを転送します。
3. 浮遊脂肪組織の層と125 mLの三角フラスコへの転送を収集し、37℃で45分間HBSSでコラゲナーゼII型（200 U / mL）を25 mLで扱う°オービタルシェーカー（125 rpm）でのC。
4. 慎重に液体画分（油と脂肪層の下）を削除し、100μmと70μmのナイロンメッシュフィルターを順次フィルタリングします。室温で10分間500gで濾液を遠心し、supernatanを吸引tと25 mLのHBSSでペレットを2回洗浄する。
5. MesenPRO RS成長サプリメントを添加した増殖培地50 mLの細胞ペレット（MesenPRO RS基礎培地）、抗生物質抗真菌剤（ペニシリンG、100μg/ mLの硫酸ストレプトマイシン、および0.25μg/ mLのアムホテリシンBの100 U / mL）を懸濁し、2 mM L-グルタミンとピペットセル2 T75フラスコ（25 / mLのフラスコ）に変換します。
6. 文化37°C（ASCは、すべての実験に使用されているパッセージ2-4）で5％CO ₂の加湿インキュベーター中でASC。

2。キトサンマイクロスフェア（CSM）を準備

注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

1. CSMは、当社の以前のプロトコル^6を使用^してイオンコアセルベーション技術とともに油中水型乳化プロセスによって調製される。大豆から成る油相混合液100 mLにキトサンの水溶液（0.5 M酢酸の3％（w / v）のキトサンの6 mL）を乳化油、n-オクタノール（1:2 v / v）で、5％ソルビタンモノオレエート（スパン80）、乳化剤、反対方向に、オーバーヘッド（1700 rpm）と同時に磁気攪拌（1000回転）を使用します。初期の架橋が発生する前に上に形成されたミセル溶液中に残っていると底に沈殿することはできませんミ​​キシングを保証し、この二重の方法。さらに、デ集約ミセル形成とrigidization中にキトサンをで磁気攪拌棒を支援します。
2. 混合物を連続的に安定した油中水型エマルションが得られるまで約1時間撹拌する。イオン架橋は4時間（24 mLの合計）のn-オクタノール15分毎に1％（w / v）の水酸化カリウムを1.5 mLの添加で開始されます。
3. 架橋反応の完了後、徐々に混合物を含むCSMの油相をデカントし、直ちにアセトン100mLに球を追加します。油相が完全に除去されるまで、アセトンで球を洗浄します。
4. 真空デシケーターと肛門に回復した球体を乾燥させさらなる処理なしyze。平均CSMの粒径、ミリグラム当たりの表面積と単位体積は、粒子サイズアナライザーを用いて決定した。
5. その後の実験では、残留塩を除去し、無水アルコールで滅菌する滅菌水でCSM 3回洗浄します。

3。 CSMの遊離アミノ基の数を決定する

注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

1. BubinsとOfner ⁷トリニトロベンゼン（TNBS）酸アッセイを用いてイオン架橋後のCSMに存在する遊離アミノ基の数を決定します。 40°Cで4時間、50 mLのガラス管に0.5％TNBS溶液1mLをマイクロスフェアの5mgをインキュベートすると2h、60℃で6N塩酸3 mLを加えて加水分解する。
2. 室温にサンプルを冷却し、脱イオン水5mLを追加することによって、自由にTNBSを抽出し、酢酸エチル10 mLのエーテル。
3. ℃で15分間水浴中で室温まで冷却し、残留エーテルを蒸発させ、水15 mLで希釈して40に水相5 mLを温める。
4. ブランクとキトサンのアミノ基の合計数を決定するためにCSMの準備のために使用されるキトサンなく、TNBS溶液を用いて、分光光度計で345 nmの吸光度を測定します。キトサンへの相対的なCSMの遊離アミノ基の数を推定する。

4。 CSMの読み込みASC

注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

1. 一晩滅菌HBSSでセクション2.5から滅菌CSMの5mgを平衡化し、8μmの細孔径の膜培養プレートインサート（24ウェルプレート）に追加します。
2. CSMはメンブレンに定住した後、慎重にHBSSを吸引し、目に増殖培地の挿入、700μLの内部に増殖培地300μLを追加インサートの外側の電子。
3. 培養プレートのインサート内部CSM上の成長培地と種子の200μLの適切な濃度で再懸濁し、ASC（1×10 ⁴から^{4×10 4）。}カルチャーインサート内の培地の最終量は、播種後、500μLです。
4. 37℃5％CO ₂の加湿インキュベーター内で24時間CSM上でASCシードをインキュベート℃に

5。 CSMでのASCの読み込みと細胞生存率の割合を決定する

注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

1. インキュベーション後、インサート膜に移行した細胞を乱すことなく滅菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブにASCにロードされたCSMを収集します。
2. 残留培地を除去し、チューブに新鮮な増殖培地250μLを追加します。
3. 各チューブに[3 - （4,5 - dimethylthiozole -2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロマイド]を25μLMTTを追加する溶液（5 mg / ml）と37℃5％CO ₂の加湿インキュベーター中で4時間インキュベート℃、
4. インキュベーション後、培地を除去し、ジメチルスルホキシドの250μLを追加し、ホルマザンの複合体を可溶化するために2から5分間ボルテックス混合物を。
5. 5分間2700×gでCSMを遠心し、その基準として630 nmを用いて570 nmで測定した上清の吸光度を決定します。
6. 実行可​​能なASCの知られている番号から得られた吸光度値からの相対CSMに関連付けられている細胞数を決定します。

6。 ASC-CSM-組み込みコラーゲンゲルを特徴付ける

注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

1. 2 N NaOHを用いて6.8にpHを調整した後、Bornstein ⁸とフィブリル化の方法に従って、ラットの尾の腱から抽出された1型コラーゲン（7.5 mg / ml）と混合ASCにロードされたCSM（5 mgを≈2×10 ⁴細胞を含む）。
12ウェルプレートにフィブリル化コラーゲン-ASC-CSM混合物を追加し、37℃5％CO ₂の加湿インキュベーター中で30分間インキュベート℃、
2. 完全に心房細動の後、37℃で最大5％CO ₂の加湿インキュベーター内で14日間のためにコラーゲン-ASC-CSMゲルをインキュベート
3. ゲルにCSMからの細胞の放出と移行は、標準的な顕微鏡技術を用いて観察した。

7。代表的な結果

本研究では、コラーゲンゲル足場にキトサンミクロスフェア（CSM）から幹細胞を提供するためにin vitroでの戦略を開発しました。均一な大きさ（直径175から225μm）と組成の多孔CSMは、細胞のキャリア（ 図2）として調製し使用しました。 CSMとASCをインキュベートすると、細胞は、CSMの2×10 ⁴ cells/5mgの濃度で接続されている。糸状仮足を延長しながら細胞は、マイクロスフェアを介して拡散することができましたミクロスフェア（ 図3）の多孔質の隙間に。セルにロードされたCSMは、コラーゲンゲルと混合した後、細胞はすぐにゲル（ 図4）に移行し始めました。

表1。幹細胞デリバリーシステムのキトサンとコラーゲンの使用のための生物学的利点があります。

図1回路図は、ASC-CSMロードされたコラーゲンの足場の二重使用のための全体的な戦略を描いた。 図2、3、4、画像の解釈を支援するための回路図内で注釈が付けられています。

図2の模式図では、キトサンミクロスフェアに幹細胞を播種の過程を描いた。 PROCμmの孔径の膜培養プレートインサート - ESSは8 CSMと共培養ASCが含まれます。 24時間後、微小球は、挿入から削除され、生体マトリックス中に埋め込むための準備が整いました。

図3。ASCとCSM-ロードされた形態学的特性。パネルBは共焦点蛍光顕微鏡によって得られた画像を重ね合わせたビューの同じフィールドを示しているパネルは、ASCにロードされたのCSMの光顕微鏡写真を示しています。 ASCは、カルセインAM（緑色）がプリロードされた。パネルDは、ミクロスフェア（アスタリスク）にロードされた細胞を示しているパネルCは、無負荷時のマイクロスフェアのSEM像のイメージを示しています。パネルEのTEMイメージがアンロードされたミクロスフェアの断面を示しています。毛穴や割れ目の多数は、フェア全体に配置されています。パネルFは、細胞とのクロス切片ミクロスフェア（矢印）を接続し、CREに糸状仮足を延長を示しています。悪徳。オリジナル倍率：A＆B = 70X、C = 500分の1、D = 2,000×、E＆F = 2,500 X。

図4三次元コラーゲンスキャフォールドにCSMからASCの移行。パネルAおよびBは、細胞が離れてミクロスフェアからの移行で、3日目にコラーゲンマトリックス（矢印）にCSMを描いています。パネルBは、12日後に同様の文化を示しています。透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、ミクロスフェア（矢印）からの移行細胞とのクロス切片であったミクロスフェアを表示CとDにC、D、およびEアスタリスクで示されている。パネルDの高倍率は、パネルEに示すように、コラーゲン線維（挿入図）に接続されているセルの糸状仮足を示しています。オリジナル倍率：A＆B = 100倍、C＆D = 6,000 X; E = 20,000、はめ込み= 150,000 X。

図5。回路図は、再生医療とドラッグデリバリーにおけるCSMの広大な使用方法を描いた。

ディスカッション

幹細胞ベースの治療の主要なハードルは、修理のために指定された領域への細胞の送達のための効率的な方法を開発しています。患者変動への患者の、組織の種類、損傷の大きさと深さのために、幹細胞を提供する方法論は、ケースバイケースで決定する必要があります。マトリックス内の幹細胞を埋め込み、創傷部位にそれらを提供する組織工学のための次の論理的なアプローチであるように見えますが、いくつかの技術的なハードルが残っています。これは、マトリックスに接続し、細胞は、添付増殖アノイキス^9月10日の前に適した微小環境を再確立することができる周囲の生体適合性を提供するために埋め込 ​​まれた細胞の機能が含まれています。このプロセスは、細胞は、幹細胞の増殖、遊走、分化、所望の細胞プロセスの前に達成するために数日かかることができるプロセスを彼らのマトリックスのリモデリング機構をアップレギュレートする必要があります。これらの問題を回避するため、我々はHAVEは、損傷組織の修復するために適切な行列にそれらを埋め込む前にキトサンミクロスフェアにプリロード幹細胞への方法を開発しました。当社独自のイオン架橋ミクロスフェアを調製するためのメソッドを使用して、プ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/装置の名前	会社	カタログ番号	コメント
ハンクスBalancedSalt溶液（HBSS）	ギブコ	14175	消耗品
ウシ胎児血清	ハイクローン	SH30071.03	消耗品
コラゲナーゼタイプII	Sigma-Aldrich社	C6685	消耗品
70μmのナイロンメッシュフィルター	BDバイオサイエンス	352350	消耗品
100μmのナイロンメッシュフィルター	BDバイオサイエンス	352360	消耗品
MesenPRO増殖培地システム	インビトロジェン	12746-012	消耗品
L-グルタミン酸	ギブコ	25030	消耗品
T75組織培養フラスコ	BDバイオサイエンス	137787	消耗品
キトサン	Sigma-Aldrich社	448869	消耗品
酢酸	Sigma-Aldrich社	320099	消耗品
n-オクタノール	アクロスオーガニック	150630025	消耗品
ソルビタン、モノオレイン酸	Sigma-Aldrich社	S6760	消耗品
水酸化カリウム	Sigma-Aldrich社	P1767	消耗品
アセトン	フィッシャー·サイエンティフィック	L-4859	消耗品
エタノール	Sigma-Aldrich社	270741	消耗品
トリニトロベンゼンスルホン酸	Sigma-Aldrich社	P2297	消耗品
塩酸	Sigma-Aldrich社	320331	消耗品
エチルエーテル	Sigma-Aldrich社	472から484	消耗品
8μmの組織培養プレートインサート	BDバイオサイエンス	353097	消耗品
1.5 mlのマイクロ遠心チューブ	フィッシャー	05-408-129	消耗品
MTT試薬	インビトロジェン	M6494	消耗品
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich社	D8779	消耗品
Qtracker細胞標識キット（Qトラッカー655）	分子プローブ	Q2502PMP	消耗品
1型コラーゲン	Travigen	3447-020-01	消耗品
水酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich社	S8045	消耗品
12ウェル組織培養プレート	BDバイオサイエンス	353043	消耗品
遠心分離	エッペンドルフ	5417R	機器
オービタルシェーカー	ニューブランズウィック州Scienctific	C24	機器
空気-5％CO 2の加湿インキュベータ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	370	機器
オーバーヘッドスターラー	IKA	Visc6000	機器
マグネチックスターラー	コー​​ニング	PC-210	機器
減圧デシケーター	-	-	機器
粒径分析器	マルバーン	STP2000 Spraytec	機器
水浴	フィッシャー·サイエンティフィック	Isotemp210	機器
分光光度計	ベックマン	ベックマン·コールターDU800UV/Visible分光光度計	機器
渦	Diagger	3030a	機器
マイクロプレートリーダー	モレキュラーデバイス	SpectraMax M2	機器
光/蛍光顕微鏡	オリンポス	IX71	機器
共焦点顕微鏡	オリンポス	FV-500レーザー走査型共焦点顕微鏡	機器
走査型電子顕微鏡	カールツァイスマイクroImaging	レオ435 VP	機器
透過型電子顕微鏡	JEOL	JEOL 1230	機器