マウス内耳は、その発達プログラム妊娠中に詳述されているプラコード由来の感覚器官である。我々は定義され子宮内で遺伝子導入技術：マウス腹開腹、transuterineマイクロインジェクションし、エレクトロポレーション。我々は、重要な実験発生学的手法を実証するためにデジタルビデオ顕微鏡を使用しています。
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この記事について
サマリー
要約
、卵形嚢と球形嚢の斑およびコイル蝸牛のコルチ器官半規管の膨大部の3クリステ：哺乳類の内耳は、6異なる感覚上皮を持っています。コルチ器官における聴覚有毛細胞は、1を聞くための主要なトランスデューサている間。クリステと斑は、バランスの特別な感覚を補助するために機械的刺激を伝達する前庭有毛細胞が含まれてい三半規管と蝸牛のこれらの感覚上皮および形態形成における細胞運命の仕様では、マウスの妊娠第2週に行われ、大部分は出生2,3前に完了されています。マウス内耳の発達の研究は、日常的に4,5の細胞および/ または形態学的表現型の分子的基盤への洞察を得るために別の胚または出生後の段階でトランスジェニック胚を採取して実施しています。我々は子宮内での開発、マウス内耳にその遺伝子伝達を仮定する</ em>は、利得と損失の機能研究の文脈で哺乳類の内耳の開発6の根底にある遺伝的メカニズムの尋問のための伝統的なマウスの遺伝子組換えへの無料アプローチを表しています。
開発マウス内耳における遺伝子強制発現研究を実施するための実験パラダイムは、ここで示した3つの一般的な手順に解決される：1）腹開腹2）transuterineマイクロインジェクション、3） 生体内エレクトロポレーションインチ腹開腹術は、移植胚は7〜実験的なアクセスを得るために子宮の外部化を可能にするマウスの生存率手術手技である。 Transuterineマイクロインジェクションは、耳胞や耳胞の内腔に発現プラスミドを導入するための面取り、ガラスキャピラリーマイクロピペットを使用することである。in vivoでのエレクトロポレーションでは、前駆細胞の8-10に発現プラスミドを駆動するために方形波、直流パルスのアプリケーションです。
11の各ステップで詳細なメモが含まれています。マウスの実験発生学的テクニックが散文から学び、静止画だけでは困難な場合があります。本研究では、我々は、遺伝子導入の手順の3つのステップを示しています。最も批判的に、我々は正確にどのように表示するためにデジタルビデオ顕微鏡をデプロイします。1） 子宮内で胎児の向きを識別する、2）耳胞に注射を標的とするための胚を再設定する、3）耳胞にトレーサー染料溶液と混合し、DNAを顕微注入胚の日11.5と12.5 4）注入された耳胞をエレクトロポ、5）ラベルは、出生時に出生後の選択のための胚をエレクトロポレーション。一般的な方法論的なエラーを回避する方法について説明;耳胞mistargetingの最も一般的な原因に絵のガイド、私たちは正常にトランスフェクトし、内側の耳の代表的な例を提供し、 子宮 g で書くための本ガイドラインエン転送動物ケアのプロトコル。
プロトコル
1。腹開腹
- ペントバルビタールナトリウム麻酔液（グラム体重あたり7.5μL）の腹腔内注射によって、その胚を胚11.5日（膣栓が検出された日の正午には胚発生の日0.5ですE11.5）にあるダムを麻酔。麻酔液作業;無水エタノールを100μL、65 mg / mLの水溶液を硫酸マグネシウム（子宮のトーンを調節する）の320μL、50 mg / mLのペントバルビタールナトリウム溶液180μLおよびプロピレングリコール400μL（と車両の混和を、水性および有機コンポーネント）。
- 足のスクイズを、テールピンチ、そして頬と鼻毛タッチへの応答を点滅させる：有害刺激テストを実施することにより麻酔の完全性を評価します。角膜に無菌眼軟膏を適用します。
- 恥骨部から鋏で胸郭と細かい刃（オスター＃40ブレード）に腹部の毛を剃る。 70％エタノールで腹部、10％ポビドンヨード（Betadine）、消毒ND 70％エタノール、順番に。場所は、滅菌ドレープの上にマウス腹部面を下にして、2から5分の加熱パッドや温かいプレート（37℃）に設定された。
- ボール先端はさみで腹側正中の腹部皮膚を切開。 10〜14ミリメートルのための切開を拡張します。 白線 、腹壁の腹側正中線に沿って血管、白の結合組織のバンドを識別します。ボールがはさみをひっくり返して白線を切開して切開10〜14ミリメートルを拡張します。すぐに温め（37℃）乳酸リンゲル液で腹部を灌漑。
- 注入部位に過度の圧力を適用せずにリング鉗子で子宮の二本の角を外部化します。予熱し、乳酸リンゲル液で外部化された子宮角を灌漑。
2。 Transuterineインジェクション
- 12月16日μ：次のような特性を持つ厚肉、ホウケイ酸ガラスキャピラリーマイクロインジェクションピペットを作製メートルの外径と20度のベベル。 、圧力= 200;速度= 46; = 0を引く時間= 100）熱=ランプのテストに加えて3台：小さなボックスフィラメントとサッターP-97ピペットプラーで、次のプログラムを使用します。サッターBV-10 bevelerで、大口径のピペット用104C（金）の研磨ディスクを使用します。カルシウム遊離リン酸で3-4μg/μLのプラスミドで再懸濁し式は液（pH 7.4）緩衝生理食塩水。濃縮されたDNAは、30秒間穏やかにボルテックスし、10秒、10,000 gでスピンに結晶の高速グリーンを追加します。視覚的に注射の有効性を追跡するために要求される高速グリーンの最小量は、経験的に決定されています。 DNA /ファストグリーンソリューションを斜めピペットのバックフィル。圧力インジェクタ（Picospritzerは、ソースガスとして、> 99％純粋な窒素を使用して）ピペットホルダーにロードされたインジェクションピペットを接続します。
- 低強度は、その注入サイト内の胚を視覚化するためのハロゲンライトで子宮を光を通過させる。 BEAを識別するティン心臓、脳胞、肢芽、後脳の発生期の第 4脳室、アイ。子宮を温めておいで2分毎に灌漑、水和を維持するためにリンゲル液を乳酸。胚の方向、位置を変更すると上記のように解剖学的ランドマークを識別するために、子宮にやさしい圧力を適用します。
- 東洋の前部と後部枝脇腹耳胞が存在する間葉系領域のプライマリ頭静脈を識別するための胚。適切な耳胞は、子宮の透視によって見ることができません。耳胞は、静脈の主幹と一緒に、アメリカンフットボールのフィールド上に支柱またはゴールポストの形状を形成し、主頭静脈の前部と後部の枝の間の中間に位置しています。耳胞は、支柱の間に中間です。
- 耳胞の推定位置と線の軌跡で子宮を介して注入ピペットを挿入します。 uterを通過した後、一度インジェクターパルスを発生私達は、トレーサー色素およびピペットチップのおおよその位置を可視化する。深さを評価するために、再びマイクロ制御とパルスの下にピペットを進めています。さらに繰り返して外側頭の間充織とパルスにピペットを進めています。成功した耳胞のターゲティングは、背側リンパ管と前庭のホタテ貝殻形状のテーパー形状を明らかにする。子宮に圧力を解放し、1モーションで胚/子宮からピペットを削除し、すぐに温めて子宮を灌漑、リンゲル液は乳酸。
（3）in vivoでのエレクトロポレーション
- 乳酸リンゲル液で子宮を灌漑。新たに適用された乳酸リンゲル液は、電気的にカップルパドルスタイルの電極に子宮に必要である。乳酸リンゲルと電極のタングステンの表面を湿らせます。電極のパスの中心に注入耳胞。静かにエレクトロポレーションpaで子宮を圧迫ddles。カソードは、注入された耳胞に横方向の子宮壁に接触しているとアノードuninjected耳胞に隣接した子宮壁と接触している。エレクトロでフットペダルスイッチ付方形波パルス列をトリガします。エレクトロポレーションパラメータは次のとおりです。パルスあたりの43ボルト、950ミリ秒のパルス間の遅延で5、50ミリ秒のパルス。パルスが配信された直後に子宮を灌漑。組織に供給される電流を記録する：60から100 mAmpsは、耳の上皮前駆細胞をトランスフェクトするのに十分である。ダムごとに4-6、E11.5の胚を注入し、エレクトロポ。
- 内側の耳のあるそれらの胚の第 4脳室への水性蛍光デキストラン（発現プラスミドは、緑色蛍光タンパク質をコードしている場合のAlexa Fluor 488発現プラスミドは、赤色蛍光タンパク質またはアレックスFluor 594のをエンコードしている場合）の第二の、独立したtransuterineマイクロインジェクションを実行します。正確に注入し、パルス当たりの電流の少なくとも60 mAmpsは事実であったエレクトロポレーション中ンプのほう。蛍光デキストランは、後脳では出生時に検出でき、内側の耳（3.5を参照）胚発生時に操作された仔の選択が可能になります。
- 乳酸リンゲルと子宮角を灌漑。腹腔内に子宮角を挿入します。予熱し、乳酸リンゲル液2-4 mLで子宮腔をフラッシュし、オーバーフローが滅菌ドレープに切開部位の外に排出することができます。乾燥、滅菌材料とドレープを交換してください。非切削針と6から0吸収性縫合糸で腹壁を縫合。我々は腹壁と皮膚の両方について、他のすべてのステッチをロックして、ランニングステッチを好む。
- ダムの毛皮を乾燥させ、皮下注射により非ステロイド性抗炎症などのメロキシカムとして管理することができます。滅菌ドレープで温め回復ケージにダムを返します。ダム '呼吸、切開部位の開存性と、流血の放電のために膣を監視し、記録します。出血は、RAである彼女は全身麻酔下にある間、再が存在し、衰えない場合には、ダムを安楽死させる。彼女は意識と歩き回るしようとする試みを取り戻す時間に注意してください。彼女は食べたり飲んだりの兆候を示しており、巣を構築し始めたときにマウスの植民地にダムを返します。通常、これは12時間以内に発生します。
- 出生時（生後0日目）、フラッシュGFPまたはテキサスレッドフィルタでstereofluorescence解剖顕微鏡を用いた蛍光デキストランを検出するごみの各子犬の後脳領域は、必要に応じて設定します。後脳のラベルを表示し、それらの仔だけ授乳中のダムに戻ります。
4。代表的な結果
図1。開発蝸牛へエレクトロポレーションによる遺伝子導入。E11.5耳胞をコードする発現プラスミド強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）とエレクトロポレーション（パルスTRAを注入したパラメータ：5、50ミリ秒/パルス、950ミリ秒のパルス間の遅延）で43ボルトのパルス。耳胞蝸牛の中間ターンを介して基地からEGFP発現を示すE11.5で注入し、エレクトロポレーションされた子犬生後6日目（P6）からA）代表的な内耳。蝸牛の外側壁は、中間ターンの頂点のみから削除されました。頂点を生じさせるE11.5前駆細胞はトランスフェクションしていませんでした。 B）で蝸牛の免疫染色ホールマウント（A）は、有毛細胞のマーカーで、ミオシン7aの（MYO7A）は、そのEGFPの発現はコルチ器官の軌跡をたどり、著しく髪細胞有利子感覚上皮に局在していることを示します。耳胞E11.5で注入し、エレクトロポレートしたE18.5胚からC）代表的な内耳。レーザー共焦点投影MYO7A陽性感覚毛細胞のEGFP発現を示しています。 EGFP expressioを示すコルチE18.5臓器から蝸牛感覚上皮のD）レーザー共焦点顕微鏡投影nの内側の有毛細胞（IHC）、外有毛細胞（OHC）、インナーphalangial細胞（IPC）、柱細胞（PC）、およびダイテルス '細胞（DC）であった。 （B）中のスケールバーは（）に適用されます。
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ディスカッション
開発マウス内耳への遺伝子導入：マウス内耳は、着床後の開発12,13の最初の週の間に耳プラコードから発生する。胎生9.5（E9.5）で、プラコードは陥入しており、耳胞2と呼ばれる液体で満たされた小胞に変身。小胞の耳前駆体は、成熟した内耳など前庭と聴覚感覚上皮に機械的に敏感な有毛細胞を支配するニューロン内の感覚と非感覚細胞を生じさせる。後期胚の段階では、内耳の膜迷路の複雑な3次元形態は3,12を確立されています。ゲインおよび機能喪失実験的な治療法は、典型的には、細胞の運命仕様とパターン形成などの発生過程の遺伝的調節への洞察を得るために、マウスの遺伝子組換えによって実行されます。開発マウス内耳のダイナミックな遺伝子操作で子宮は、マウスの実験発生学6,11夫婦の遺伝子導入技術、マウスの遺伝子組換えへの無料アプローチを表しています。
ウイルスやエレクトロポレーションによる遺伝子導入技術が開発内耳6,11,14,15で遺伝子発現を操...
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
私たちは、もともとリファレンス11の130ページに登場し、マイクロインジェクションピペットの作製図を公開する許可をヒューマナプレスに感謝し、ビデオ撮影のためにラリーDlugasとスティーブン·ウォン、教育コミュニケーションのOHSU部、ビデオのデザインと編集のためのラリーDlugas、アダムM. O "クイン、シニアデザイナー、技術的な回路図を提供するため、カスタムの水平層流フードとLesゴールドスミスを設計するためのトリオン/ Envirco、ビクターMonterroso、MV、MS、PhDは、トム·Chatkupt、DVM、比較医学のOHSU部、指導のための私達の動物のケアのプロトコル、手術手技、および予防的鎮痛療法、マルセル·ペレ-Gentilの、DVM、MS、獣医縫合のテクニックで彼の資料を共有するため、私たちのAdobe Premiere Proのビデオ顕微鏡のコンピュータワークステーションを設計するためのエドワードPorsov、MS、およびリア白と（ポートランド、オレゴン州）キャプションLNSのジョナスヒンクリー。この作品は、難聴とオットの国立研究所からの補助金によって支えられてrのコミュニケーション障害：DC R01 008595とDC R01 008595-04S2（JB）およびP30 DC005983（オレゴン聴覚研究センターコアグラント、ピーター·ガレスピー、主任）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| マイクロ滅菌ケース | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25インチ |
| ボール先端がはさみ | ファイン科学ツール | 14109から09 | |
| リング鉗子 | ファイン科学ツール | 11106から09 | 4.8ミリメートルOD ID/6mm |
| アドソンティッシュ鉗子 | ファイン科学ツール | 11027から12 | |
| 針ドライバ | ファイン科学ツール | 12502から12 | |
| アレルギーシリンジトレイ | ベクトン·ディクソン | 305536 | |
| 縫合6から0 | Syneture | GL-889 | 0.7メトリック消化管縫合 |
| 乳酸リンゲル注射液USP | バクスター | 2B2323 | |
| 速いグリーン | シグマアルドリッチ | F7258 | |
| ホウケイ酸ガラスは、キャピラリ | ハーバード装置 | 30から0053 | |
| ネンブタールナトリウム溶液 | OVATION製薬株式会社 | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | フィッシャー·サイエンティフィック | M63-500 | |
| プロピレングリコール | フィッシャー·サイエンティフィック | P355-1 | |
| エタノール | シグマアルドリッチ | E7023-500 | |
| メロキシカム | ベーリンガーIngeheim | NADA 141から219 | |
| マイクロピペットプラー | サッター·インスツルメンツ | P-97 | FB255Bボックスのフィラメント、サッター機器からピペットクックブックを参照してください |
| 微小電極Beveler | サッター·インスツルメンツ | BV-10 | 大ピペット用104Cベベルディスク、理論をベベルの取扱説明書を参照してください |
| マイクロピペットホルダー | ワーナー·インスツルメンツ | MP-S15T | Picospritzerチューブ用外径1.5ミリメートルのピペットとメス圧力ポートのために。 |
| ピンセットスタイルの電極 | テックインターナショナル株式会社 | CUY650P5 | 5ミリメートル、外径 |
| 方形波エレクトロ | テックインターナショナル株式会社 | CUY21EDIT | フットペダルを推奨 |
| PICOSPRITZER III | パーカー·ハネフィン | 051-0500-900 | フットペダルを推奨 |
| 手動制御マニピュレーター | ハーバード装置 | 640056 | |
| 水平層流クリーンベンチ | Envirco | LF 630から10554へのカスタム変更。フードの回路図の補足情報を参照してください。 | |
| ライカstereofluorescenceはLumencor SOLA光エンジンとmicrocopeを解剖 | バーテルズとスタウトとLumencor | Lumencor SOLA光エンジンとMZ10F | MZ10Fを集中するとSOLAのライトエンジンをトリガするためにFootpedalsが推奨されます |
| Alexa Fluor 594のデキストラン | インビトロジェン | D22913 | 10mg/ml、水性 |
| のAlexa Fluor®488デキストラン | インビトロジェン | D22910 | 10mg/ml、水性 |
| エンバイロ-DRI | シェパード専門診ERS | www.ssponline.com |
参考文献
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