開発マウス内耳への遺伝子導入によるエレクトロポレーション

1。腹開腹

1. ペントバルビタールナトリウム麻酔液（グラム体重あたり7.5μL）の腹腔内注射によって、その胚を胚11.5日（膣栓が検出された日の正午には胚発生の日0.5ですE11.5）にあるダムを麻酔。麻酔液作業;無水エタノールを100μL、65 mg / mLの水溶液を硫酸マグネシウム（子宮のトーンを調節する）の320μL、50 mg / mLのペントバルビタールナトリウム溶液18​​0μLおよびプロピレングリコール400μL（と車両の混和を、水性および有機コンポーネント）。
2. 足のスクイズを、テールピンチ、そして頬と鼻毛タッチへの応答を点滅させる：有害刺激テストを実施することにより麻酔の完全性を評価します。角膜に無菌眼軟膏を適用します。
3. 恥骨部から鋏で胸郭と細かい刃（オスター＃40ブレード）に腹部の毛を剃る。 70％エタノールで腹部、10％ポビドンヨード（Betadine）、消毒ND 70％エタノール、順番に。場所は、滅菌ドレープの上にマウス腹部面を下にして、2から5分の加熱パッドや温かいプレート（37℃）に設定された。
4. ボール先端はさみで腹側正中の腹部皮膚を切開。 10〜14ミリメートルのための切開を拡張します。 白線 、腹壁の腹側正中線に沿って血管、白の結合組織のバンドを識別します。ボールがはさみをひっくり返して白線を切開して切開10〜14ミリメートルを拡張します。すぐに温め（37℃）乳酸リンゲル液で腹部を灌漑。
5. 注入部位に過度の圧力を適用せずにリング鉗子で子宮の二本の角を外部化します。予熱し、乳酸リンゲル液で外部化された子宮角を灌漑。

2。 Transuterineインジェクション

1. 12月16日μ：次のような特性を持つ厚肉、ホウケイ酸ガラスキャピラリーマイクロインジェクションピペットを作製メートルの外径と20度のベベル。 、圧力= 200;速度= 46; = 0を引く時間= 100）熱=ランプのテストに加えて3台：小さなボックスフィラメントとサッターP-97ピペットプラーで、次のプログラムを使用します。サッターBV-10 bevelerで、大口径のピペット用104C（金）の研磨ディスクを使用します。カルシウム遊離リン酸で3-4μg/μLのプラスミドで再懸濁し式は液（pH 7.4）緩衝生理食塩水。濃縮されたDNAは、30秒間穏やかにボルテックスし、10秒、10,000 gでスピンに結晶の高速グリーンを追加します。視覚的に注射の有効性を追跡するために要求される高速グリーンの最小量は、経験的に決定されています。 DNA /ファストグリーンソリューションを斜め​​ピペットのバックフィル。圧力インジェクタ（Picospritzerは、ソースガスとして、> 99％純粋な窒素を使用して）ピペットホルダーにロードされたインジェクションピペットを接続します。
2. 低強度は、その注入サイト内の胚を視覚化するためのハロゲンライトで子宮を光を通過させる。 BEAを識別するティン心臓、脳胞、肢芽、後脳の発生期の^第 4脳室、アイ。子宮を温めておいで2分毎に灌漑、水和を維持するためにリンゲル液を乳酸。胚の方向、位置を変更すると上記のように解剖学的ランドマークを識別するために、子宮にやさしい圧力を適用します。
3. 東洋の前部と後部枝脇腹耳胞が存在する間葉系領域のプライマリ頭静脈を識別するための胚。適切な耳胞は、子宮の透視によって見ることができません。耳胞は、静脈の主幹と一緒に、アメリカンフットボールのフィールド上に支柱またはゴールポストの形状を形成し、主頭静脈の前部と後部の枝の間の中間に位置しています。耳胞は、支柱の間に中間です。
4. 耳胞の推定位置と線の軌跡で子宮を介して注入ピペットを挿入します。 uterを通過した後、一度インジェクターパルスを発生私達は、トレーサー色素およびピペットチップのおおよその位置を可視化する。深さを評価するために、再びマイクロ制御とパルスの下にピペットを進めています。さらに繰り返して外側頭の間充織とパルスにピペットを進めています。成功した耳胞のターゲティングは、背側リンパ管と前庭のホタテ貝殻形状のテーパー形状を明らかにする。子宮に圧力を解放し、1モーションで胚/子宮からピペットを削除し、すぐに温めて子宮を灌漑、リンゲル液は乳酸。

（3）in vivoでのエレクトロポレーション

1. 乳酸リンゲル液で子宮を灌漑。新たに適用された乳酸リンゲル液は、電気的にカップルパドルスタイルの電極に子宮に必要である。乳酸リンゲルと電極のタングステンの表面を湿らせます。電極のパスの中心に注入耳胞。静かにエレクトロポレーションpaで子宮を圧迫ddles。カソードは、注入された耳胞に横方向の子宮壁に接触しているとアノードuninjected耳胞に隣接した子宮壁と接触している。エレクトロでフットペダルスイッチ付方形波パルス列をトリガします。エレクトロポレーションパラメータは次のとおりです。パルスあたりの43ボルト、950ミリ秒のパルス間の遅延で5、50ミリ秒のパルス。パルスが配信された直後に子宮を灌漑。組織に供給される電流を記録する：60から100 mAmpsは、耳の上皮前駆細胞をトランスフェクトするのに十分である。ダムごとに4-6、E11.5の胚を注入し、エレクトロポ。
2. 内側の耳のあるそれらの胚の^第 4脳室への水性蛍光デキストラン（発現プラスミドは、緑色蛍光タンパク質をコードしている場合のAlexa Fluor 488発現プラスミドは、赤色蛍光タンパク質またはアレックスFluor 594のをエンコードしている場合）の第二の、独立したtransuterineマイクロインジェクションを実行します。正確に注入し、パルス当たりの電流の少なくとも60 mAmpsは事実であったエレクトロポレーション中ンプのほう。蛍光デキストランは、後脳では出生時に検出でき、内側の耳（3.5を参照）胚発生時に操作された仔の選択が可能になります。
3. 乳酸リンゲルと子宮角を灌漑。腹腔内に子宮角を挿入します。予熱し、乳酸リンゲル液2-4 mLで子宮腔をフラッシュし、オーバーフローが滅菌ドレープに切開部位の外に排出することができます。乾燥、滅菌材料とドレープを交換してください。非切削針と6から0吸収性縫合糸で腹壁を縫合。我々は腹壁と皮膚の両方について、他のすべてのステッチをロックして、ランニングステッチを好む。
4. ダムの毛皮を乾燥させ、皮下注射により非ステロイド性抗炎症などのメロキシカムとして管理することができます。滅菌ドレープで温め回復ケージにダムを返します。ダム '呼吸、切開部位の開存性と、流血の放電のために膣を監視し、記録します。出血は、RAである彼女は全身麻酔下にある間、再が存在し、衰えない場合には、ダムを安楽死させる。彼女は意識と歩き回るしようとする試みを取り戻す時間に注意してください。彼女は食べたり飲んだりの兆候を示しており、巣を構築し始めたときにマウスの植民地にダムを返します。通常、これは12時間以内に発生します。
5. 出生時（生後0日目）、フラッシュGFPまたはテキサスレッドフィルタでstereofluorescence解剖顕微鏡を用いた蛍光デキストランを検出するごみの各子犬の後脳領域は、必要に応じて設定します。後脳のラベルを表示し、それらの仔だけ授乳中のダムに戻ります。

4。代表的な結果

図1。開発蝸牛へエレクトロポレーションによる遺伝子導入。E11.5耳胞をコードする発現プラスミド強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）とエレクトロポレーション（パルスTRAを注入したパラメータ：5、50ミリ秒/パルス、950ミリ秒のパルス間の遅延）で43ボルトのパルス。耳胞蝸牛の中間ターンを介して基地からEGFP発現を示すE11.5で注入し、エレクトロポレーションされた子犬生後6日目（P6）からA）代表的な内耳。蝸牛の外側壁は、中間ターンの頂点のみから削除されました。頂点を生じさせるE11.5前駆細胞はトランスフェクションしていませんでした。 B）で蝸牛の免疫染色ホールマウント（A）は、有毛細胞のマーカーで、ミオシン7aの（MYO7A）は、そのEGFPの発現はコルチ器官の軌跡をたどり、著しく髪細胞有利子感覚上皮に局在していることを示します。耳胞E11.5で注入し、エレクトロポレートしたE18.5胚からC）代表的な内耳。レーザー共焦点投影MYO7A陽性感覚毛細胞のEGFP発現を示しています。 EGFP expressioを示すコルチE18.5臓器から蝸牛感覚上皮のD）レーザー共焦点顕微鏡投影nの内側の有毛細胞（IHC）、外有毛細胞（OHC）、インナーphalangial細胞（IPC）、柱細胞（PC）、およびダイテルス '細胞（DC）であった。 （B）中のスケールバーは（）に適用されます。

利害の衝突が宣言されません。