マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

Summary

本稿では、同時に複数の認知行動をテストし、げっ歯類のために神経活動を記録することができる完全に自動化された汎用性の高いシステムを提案する。

Abstract

我々は、複数の認知の脳機能は、単一のタスクシーケンスで検討することが可能なオペラント行動試験と神経活動の記録のための完全に自動化されたシステムを開発しました。このシステムのユニークな特徴は、ほとんどの市販のチャンバー内の聴覚キューコントロールに関連付けられた問題の多くを排除し、カスタムメイド、音響透過チャンバーです。オペラントデバイスを追加または交換することができる容易さは聴覚、視覚、嗅覚と行動のさまざまなタスクの実装を可能にし、このシステムは非常に汎用性になります。システムの自動化は微細な時間（10 ms）の制御とあらかじめデザインされた行動シーケンス内の各イベントの正確なタイムスタンプすることができます。マルチチャンネルの電気生理学的記録システムと組み合わせると、そのような動機、注意、意思決定、忍耐、そして報酬として、複数の認知の脳機能は、順次、または独立して調べることができます。

Protocol

システム概観

システムは3つの主要コンポーネントで構成さ：（2）複数のチャネルの電気生理学的記録システム（Neuralynx、ボーズマン、モンタナ州）（1）二重壁の防音ルーム（産業用音響会社、ブロンクス、ニューヨーク州）と（3）医学·アソシエイツ株式会社（セントオールバンズ、VT）から完全に自動化され、カスタマイズされた行動試験システム。

図1Aに示すように、オペラント室は防音室の内側に位置しています。電気生理学的記録システム（ 図1a-A）にヘッドからのケーブルを接続するための整流器（型式SL-36、トンボの研究開発、（株）、リッジリー、ウェストバージニア州）、および動物の行動を監視し、記録するビデオカメラは上にマウントされているオペラントチャンバー（ 図1a-B）。

カスタム設計されたオペラントチャンバー

カスタム設計され、音響透過operanトンチャンバー（ 図1a-d）は 3音響透過壁と1モジュラ操作パネル（ 図1B）で構成されています。 3人のスピーカーは（ケージツイーター、ENV_224BM、地中海·アソシエイツ）の中間の上にマウントされていると2つのサイドパネルは発光聴覚手がかりのために使用されます。聴覚手がかりは、キャリブレーション、プログラマブル·オーディオ·ジェネレータ（ANL-926）によって生成されます。刺激光（ENV_221M）と二つのトリプル刺激のLEDディスプレイ（ENV_222M）は、それぞれ中央とサイドパネルに配置されています。これらの刺激ライトは視聴覚のマルチ感覚行動テストに使用することができます。 3色のLEDが点灯（ENV_114M）と鼻突くデバイスは、中央のパネルの下部に取り付けられています。ノーズポークユニット内にインストールされている赤外線検出器は、鼻がつつくと保有期間通知するために使用されています。ノーズポークユニット内のLEDライトが穴の中にトレーニング鼻ホールドに使用することができます。可動応答レバー（ENV_112CM）はオペラントパネルの各側面にマウントされています。 mobilitこれらのレバーのyは実質的に最初のタスクのトレーニングと脳（下記参照）のいくつかの重要な認知機能の研究の両方に使用できるレバーの存在を柔軟に制御することができます。 4チャンネル赤外線コントローラ（ENV_253）によって制御される赤外線ビーム源と検出器（EVN_253SD）の4つのペアが両方の動物の位置を示しており、動物の位置に基づいて他のデバイスを制御するためにチャンバーの下部に配置され（ 図1A- E）。内蔵の赤外線歩哨（ENV_203M-45IR）を持つ2つのペレットディスペンサー各ペレットを容器（ 図1A-C）に報酬を分配するために使用されます。赤外線歩哨は、ペレットディスペンサーの障害を監視し、警告信号を提供するために使用されています。

システム構成

システムの接続とハードウェアコンポーネントの概要を図2に示されています。機能的には、二つの平行な、インタラクティブがありますサブシステム：動作訓練用と電気生理学的記録その他の。二つのサブシステムは、MED-PC IVソフトウェアプラットフォーム（SOF-735）を介して同期されます。コンピュータは、ニューラル·レコーディング·システムへの行動のデバイスとTTLパルス（信号が図2の赤い矢印で示されるフロー）にコマンドを送信し、動物の反応と神経活動（信号はそれぞれ、緑、青の矢印で示されたフローで生成された信号を受信する図2）。これらの並列の、インタラクティブなシステムでは、同期の行動/神経データの記録を有効にして、動物の神経活動に基づいた行動、あるいはその逆の操作を可能にします。

動作訓練サブシステム SmartCtrl接続パネル（SG-716B）は、双方向通信のパネルとしての役割を果たします。つまり、行動のデバイス（赤いボックスに記載されている）に、コンピュータから（ 図2の赤い矢印）の制御信号を送信し、TRansmit動物の応答信号（ 図2の緑色の矢印）戻ってコンピュータに接続します。 4チャンネル赤外線コントローラ（ENV_253）の出力は、接続パネルにルーティングされます。インターフェイスカード（SmartCtrlインターフェイスカード、DIG-716B）とデコードカード（DIG-700F）がコンピュータにインストールされているPCIカードへの接続パネル（DIG-704PCI）からの信号を通信します。聴覚手がかりもデコードカード（DIG-700F）を使用してMED-PC IVソフトウェアによって制御されている刺激発生器（ANL-926）によって生成されます。 図2に示すように、すべてのインターフェイスカードは、テーブルトップインタフェースキャビネット（SG-6080D）でホストされています。このキャビネットは、すべての動作はデバイスのための力を提供しています。

コンピュータによって受信された電気生理学的記録サブシステムの動物の応答信号は、瞬時に巨大港TTLカード（DIG-726）とチーターデジタルインターフェースボックス（Nを介して神経記録システムに送信されます。euralynx、ボーズマン、モンタナ州）（ 図2）。これらの動作のイベントはタイムスタンプと神経活動と同時に記録されます。神経スパイクはNeuralynx記録システムからオンラインでは、動物の行動を操作または干渉のための行動制御サブシステムへの入力信号として使用することができますが検出されました。逆に、動物の応答信号は、電気またはoptogenetic刺激技術と組み合わせたときの神経活動を操作したり干渉するためのトリガとして使用することができます。これらのアプローチは、神経活動と行動の間に因果関係を解明するための貴重であろう。

プログラミングと行動制御プログラムの処理データは、トランスIVソフトウェア（トーマスA. TathamとMEDアソシエイツ）と書かれており、Pascalコンパイラでコンパイルされます。各研修ステップの自動化は、MED-PC IVソフトウェアへのトランスIVプログラムをロードすることによって実現しています。訓練パラメータは、トレーナーワットオンラインで調整することができますMED-PC IVソフトウェアが実行されているhile。トランスIVコードは、システムのセットアップと行動のタスクの両方のために特定する必要があります。標準的な研修プログラムは、しかし、MED Associatesから自由に入手可能であり、個々の研究室の特定のニーズを満たすように変更することができます。私たちのセットアップで使用するトレーニングプログラムもご要望に応じて自由にご利用いただけます。

行動データは、MED-PC IVソフトウェアによって自動的に保存されます。保存したデータは、Excelプログラム（MPC2XL、トーマスA. TathamとMEDアソシエイツ）へMED-PCを使用してMicrosoft Excelファイルに変換することができます。翻訳のExcelファイルは、MATLAB環境（MathWorks社、ネーティック、マサチューセッツ州）にインポートして解析することができます。チーターソフトウェア（チーター5、Neuralynx、ボーズマン、モンタナ州）で記録された行動のイベントのタイムスタンプと一緒に神経データは、分析のためにMATLABにインポートすることができます。

トレーニング

このシステムの動作を説明するために、我々はここで説明するラットの周波数弁別閾を調べるために設計された2つの代替選択肢ピッチ弁別課題、。タスクの概略図を図3に示します。

1。事前トレーニング

1. ナイーブな大人の男性、のSprague-Dawleyラット、年齢〜60日で始まります。
2. 動物の体重は、ベースラインの広告libidum重量の約90％になるまで訓練する前に、食物摂取を制限します。

2。ケージ馴化

1. 馴化のためのチャンバを準備するには、レバーを撤回し、ノーズポークデバイスをアクティブにするから動物を防ぐために、ゴム栓（60 ccシリンジのプランジャから作られた）で鼻突く穴をブロックします。
2. 場所〜各ペレットレセプタクル（食品カップ）20完全栄養ペレット（45mgの、製品番号F0021、BioServ、フレンチ、NJ）。
3. 馴化のためにチャンバー内のナイーブな動物を配置します。ラットはすぐに食品カップを探索し、ペレットを食べるように開始されます。
4. 各食品のカップにランダムにペレットを分配することによりチャンバーの両側に移動するにはラットを強制します。一30分のセッションでは、食品カップアソシエーションを確立するため、通常は十分です。ベースラインの〜90％の一定のレベルで自分の体重を維持するために十分である300ペレット - 1 30分のセッションでは、ラットは、通常、200を取得します。

3。レバープッシュトレーニング

1. 新しいセッションでは、チャンバー内に両方のレバーを拡張し、食品のカップを空のままにします。
2. 次に、チャンバー内に馴化ラットを配置します。動物がレバーの近くに入ると、マック＆PC IVソフトウェアを介して手動でペレットを分注する。ラットなど、盗聴に触れたり、登山のように、レバーに興味を示していた場合にも報酬を提供しています。偶発的なレバープッシュも報酬automをトリガするaticallyプログラムによる。
3. レバーを押して奨励し、両方のレバーの探査を強制的に、動物が連続して限られた回数をそれぞれレバーをプッシュすることができます。制限に達したとき、レバーを撤回。両方のレバーが後退している場合には、上記の手順を繰り返し、それらを拡張します。
4. 徐々にレバーを撤回するまで、それが押されるたびに上限を減少させる。食品の報酬関連 - 1〜2 30分のセッションでは、レバープッシュを確立するために通常は十分です。

4。鼻突くトレーニング

1. 新しいセッションでは、レバーを撤回し、鼻突くからゴム栓を取り外します。ノーズポークデバイスを探索におけるラットの関心を促進するために鼻突く内部のいくつかのペレットを配置します。
2. チャンバー内に動物を再導入する。ラットは、食品ペレットの鼻突く穴を傍受し、ランダムに2つのレバーのいずれかを拡張します。
3. 拡張されたレバーを見て、ラットが近づくと食品画素を取得するためにレバーを押します。てみましょう。レバーが押されると報酬が分配された後、鼻突くデバイスを探索するラットを奨励するためにレバーを撤回。これは通常、タスクシーケンスを学ぶために30から20分程度かかります。 能勢突く → レバーエクステンション → レバープッシュ → 報酬 。

5。キュートレーニング

1. 新しいセッションでは、短い遅延（100から250ミリ秒）とノーズポークイベント後に聴覚手がかりを果たしています。それぞれの聴覚キューのプレゼンテーション直後に左と右のレバー（100ミリ）の両方を拡張します。
2. それは、聴覚信号で示されているレバーを押すだけラットに報酬を与える。動物は徐々に1レバーを使用して特定の聴覚キューを関連付ける方法を学習します。 能勢POKE→キュー → レバープッシュ → 報酬/無報酬 （ 図3）：動物は、そのシーケンスを使用して新しい試験を開始して自由である。初期の学習セッションであるため、高い偽率、補助FOODは、各トレーニングセッションの後、体重を維持するために与えられるべきである。
3. 一貫したパフォーマンスレベルに達するまで、次のいくつかの30分のセッションでは、（典型的な学習曲線は、 図3Aを参照してください）ラットの練習に、新たに学習した作業をしましょう。タスクが習得されると、ラットは約200を得ることができます - その体重を維持するために十分で各30分間のセッションで300ペレットを、。

6。代表的な結果

上記のプロトコールに従って、我々は訓練を受けたラットは、同じ周波数（F、F、F、F、F、F）または異なる周波数（F、F-ΔFのいずれかで6トーンピップで構成される純音のパルス列の二つの異なるパターンを認識する^{、F、F-ΔF、F、F-ΔF）1-5。}各トーンピップは持続時間が200ミリ秒ですとトーンピップ間隔は400ミリ秒です。本研究では、Fが10 kHzのように設定され、ΔFは1〜Fの50％（ 図3上）であった。一般的に、ΔFが設定されましたトレーニングセッションの間に比較的大きな値：トレーニングを容易にするための5 kHz、4 kHzの、3 kHzの、2 kHz、および1 kHzの、。別のΔF値を持つ各純音のパルス列は、与えられたセッションでは、ランダムに提示された。

二代替選択肢ピッチ弁別課題は、 図3に示されています。ラットは、試験を開始するには、鼻の穴（ 図1Bおよび図3下）に彼らの鼻を突くように訓練された。鼻突くには、聴覚手がかりの放送をトリガします。合図を認識すると、ラットは、チャンバの正しい側に実行レバーに近づくと、チャンバー内に拡張するためにレバーを待ってから、一定の時間ウィンドウ（レバーアクティブな時間内にレバーをプッシュするために1から2を必要とする報酬（ 図3）を得るために、秒）。ヒット率は、個々のΔF値の合計試行回数で割ったヒット試行回数としてそれぞれΔF値を算出した。 75％の基準ヒット率は、ラットがタスクを学んだことを示すために使用されていました。 1匹のラットの典型的な学習曲線を図4Aに示されています。各色のラインは、異なるΔF（ΔF0は一定のパルス列を表します）、各パルスの学習進捗状況を示しています。平均して、それは75％のヒット率の基準に達するために訓練の約7セッション（聴覚キュープレゼンテーションの最初のセッションから始まり、ステップ5キュートレーニング）をしました。

このシステムはまた、実験者によって設計されたタスクを実行する際に動物の行動の定量的特性評価を可能にします。広く動物行動の研究で使用される3つの測定結果を図4に示されているB - D反応時間は、タスクを中心に動物の注意力を反映して、聴覚キューの開始とレバープッシュの間の時間経過として測定した。動物は動物がそれぞれの試験を開始したタスクにあったか、コミットを反映間試行間隔、と偽の裁判でタイムアウトによって処罰されなかった場合、 図4Cにプロットした。動物の全体的なパフォーマンスのダイナミックなパターンを表すと改善/単一セッション内で発生する可能性があり適応を反映して、セッション内のパフォーマンスの時間的変動は、 図4Dにプロットした。各セッションは、初期、中期、および後期段階（ステージあたり10分）に分かれていた。各ステージの報酬の累積数は、この測定で使用されていた。

いくつかの認知的行動（ 図5Aおよびディスカッションを参照）の神経基盤は、タスクを実行して、動物の神経活動を記録することによって、このシステムで対処することができます。基底核（NB）とラットの脳の腹側被蓋野（VTA）で同時に記録された神経活動の例は、 図5BおよびCに示されています。ニューロンの発火は、試験の各イベント（例えば、に関連するタイムスタンプ付きです。鼻突くように、レバープッシュ、聴覚キューのプレゼンテーションと認識し、報酬の受け取り実績）と、これらの行動のタスクイベントの関係で分析した。このシステムを組み合わせた行動と神経活動の記録の結果は、認知行動の様々な神経基盤の解明に実りとなります。

図1。システムの主な成分（A）とカスタムメイドの聴覚オペラントチャンバー（B）。A.オペラントチャンバーの模式図は、二重壁の防音室に位置しています。響泡のくさびは、音の散乱と偏向を排除するために部屋の壁全体にマウントされている：神経活動記録システムにケーブルをルーティングするための整流子、B：監視と記録、動物の行動のためのビデオカメラ、C：ペレットディスペンサD：オペラントチャンバー。E：赤外線レシーバ。B.オペラントチャンバーは3音響透過壁と1モジュラ操作パネルで構成されています。詳細な説明のテキストを参照してください。

図2システムの概要図。行動訓練と神経活動記録システム：システムは、2つのサブシステムで構成されています。 2サブシステムは、対話的にTTLパルス（詳細については、 システム構成を参照）を介して互いに通信します。緑の矢印は、コンピュータにフィードバックし、動物の応答信号を示す;赤い矢印はコマンドおよび/またはコンピュータから送信された行動のイベントを表し、青い矢印は神経スパイクイベントの信号入力を表すNeuralynx記録システムとのオンラインで検出されました。

図3二代替チャンネルOICE周波数弁別課題。 トップ 、基本的なタスクシーケンスを示すブロック図。主な行動のアクションの下 、略図。緑の矢印は、タスクのシーケンシャルフローを示しています。

図4 2つの代替選択肢の周波数弁別タスクの代表的な結果A.カーブを学習：各色のラインは、各周波数変動（ΔFs）を判別する上で、ラットの学習進捗状況を表しています。暗い線は、周波数変動のための平均学習曲線を表しています。レバープッシュにキューの発症からの時間周として測定反応時間のBの分布間試験間隔のCの分布。パフォーマンスのD.時間的ダイナミクスは、測定されたセッション内でセッションの、初期、中期、および後期段階で得られた蓄積された報酬である。 ABのデータは、LL - Dは、ラットのパフォーマンスが75％のヒット率を超えていた最後の段階で得られた。

図5：システムを用いて検討することができます。A.認知行動は、認知行動と脳機能の例。トップキャプションは、一つの試験の順序で各アクションを記述します。下のキャプションは、学ぶことができる認知行動を示しています。両方のレバーがレバーがチャンバ内に延びるの処理であるdの以外のすべての画像で抽出されたこと。B.は 、2つの選択肢の聴覚タスクを実行するラットのNBに記録されているニューロンのパターンを焼成してください。 トップ 、各試行を越えて発火のラスタイメージプロット。各色の四角形は、細胞の発火を表しており、発射速度は色によってコードされています。 ボトム 、ペリであっても、発火率のtヒストグラム。アクションの前に、焼成（当時ゼロマイクロレバーを押すと、赤い点線の垂直線で示される）とアクションの後に、焼成の段階的な分散のアップ建物に注意してください。CでのVTAに記録されたニューロンの発火パターンを2選択肢の聴覚タスクを実行してラットします。このページのトップへ 、それぞれの試験にまたがる単一のVTAニューロンの発火のラスターイメージプロット。各色の四角形は、VTAニューロンの発火を表し、発火率は色でコード化されています。ラスタイメージに示すように、発火率の下 、ペリ·イベント·ヒストグラム。ラットが報酬を得ている期間中にレバー（当時の縦の赤点線で示されるゼロマイクロ秒）と、積極的な発火を押してのアクションの直前にまばらな発火に注意してください。このニューロンの活動はこれらの2つのアクション間で実質的に沈黙している。脳に移植されたタングステンstereotrodesはRECに使用されましたORD神経活動を同時にNBとVTAからラットがタスクを実行している間。スパイクソーティングはSpikeSort 3Dソフトウェア（Neuralynx、ボーズマン、モンタナ州）を使用してオフラインで行われた。

Discussion

すべての聴覚行動タスクの設計において重要な側面は、テスト環境での散乱やたわみに起因する不要な音の除去です。貧しい人々のサウンド·コントロールは、動作がテストされている重大な影響を持つことができ、誤解を招く、あるいは解釈不可能な結果を​​生成します。ここで説明するシステムで使用される行動のチャンバーは、具体的にチャンバー壁からの音のたわみを避けるために、音響的に透明になるように設計されています。確かに、室の中央から測定したとき、音たわみは（データは示さず）を効果的に検出されなかった。

我々は主に聴覚系を研究するためこのシステムを開発したが、それは簡単に他の感覚系を研究するために他の研究者によって適合させることができます。変更はシステムの全体構成を変更せずに別のタスクのためのソフトウェアとハ​​ードウェアの両方で簡単に行うことができます。モジュラー操作パネルは、システムが特にversatiなる新しい行動タスクのさまざまなデバイスの追加および/または置換を可能にすることで、ル。例えば、嗅覚行動のタスクは鼻突くデバイスに嗅覚刺激を提供することで移植することができる。 MEDアソシエイツ（ENV-115A-OF）から嗅覚刺激の5つの選択肢照らされた鼻突く壁は簡単に複雑な嗅覚のタスクの操作パネルにインストールすることができます。さらに、すべてのオペラントのデバイスが容易にシステムの構成を変更することなく、マウス用に設計されているものに置き換えることができます。

各オペラントデバイスの正確な時間的制御と同様に、与えられた裁判で、単一のイベントの高解像度記録（下記参照）別の認知の脳機能に対処するための行動タスクのデザインをカスタマイズするためのデバイスの正確な操作を可能にします。神経活動の記録と組み合わせることで、神経科学の分野における問題の豊富なこのシステムに師事することができます。例えば、内上記のuditoryタスクは、脳の認知機能に関連する次の質問は、単一の試験で検討することができます。

（1）。動機：各試験は、動物の "自発的"鼻突くアクション（図5Aおよび図3）によって開始されているので、モチベーションは、このように特定のセッションの動物によって実行される試行の合計数を測定することにより定​​量的に評価することができ、または連続した試験の数は^6,7を行った。

（2）。注意：裁判で報酬を得るためのキーが正しく聴覚手がかりを認識することである。タスクを実行するように訓練することができませんでしたラットの約25％で、聴覚手がかりに参加の欠如が大きな要因であった。対照的に、タスクのことを学んだラットでは、行動の一時停止（ 図5A-bおよび図3を参照）聴覚信号のプレゼンテーションの中で明らかになった。このシステムを使用して、それはこのように注目デフィ "の（i）の画面のラットに可能です。CITS "と動物が聴覚手がかり^8-10に出席している間に神経細胞の録音と組み合わせた場合（ⅱ）注意の神経機構を研究しています。

（3）。意思決定：聴覚手がかりの認識時には、動物は限られた時間ウィンドウ（ 図5A-C）内で正しいレバーに近づくことにするどの方向を決定する必要があります。また、このように意思決定^11,12を研究^するための効果的なパラダイムです。

（4）。忍耐：レバー拡張のタイミングは、動物がレバーが拡張されスポット（ 図5A-D）に到着した後レバーを待つ必要がありますように制御することができます。待っているの長さを変化させることによって、動物の忍耐の範囲は、テストの結果^{、13 ​​を}定量することができる。

（5）。報酬：タスクの最終的な目標は、報酬（ 図5A-Eおよび図3）を得ることである。このシステムを用いた行動のタスクは、このようにすることができ簡単に報酬の意思決定の問題と脳の^14から17の値はシステムの機能の多くの側面を勉強するように設計することができます。