細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。
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この記事について
サマリー
要約
このプロトコルは、 シロイヌナズナ実生の蛍光顕微鏡ベースのスクリーニングを説明し、分泌経路内の特定のタグ付き蛍光マーカーの細胞内分布を変化させる劣性変異をマッピングする方法について説明します。 シロイヌナズナたため、そのゲノムサイズの遺伝学的研究のための強力な生物学的なモデルであり、世代時間、王国間の分子機構の保全。分子マーカーに基づいて、従来の方法に代わるもので突然変異をマッピングするためのアプローチとして、ジェノタイピングアレイは、比較的高速であるため有利であると本当に短い時間枠のいくつかの変異体のマッピングを可能にすることができる。この方法は、植物のどのオルガネラの整合性に影響を与えることができるタンパク質の同定を可能にします。ここでは、一例として、我々は小胞体（ER）の整合性のための重要なマップの遺伝子に画面を提案する。我々のアプローチは、しかし、簡単に他の植物の細胞小器官に拡張することができます（例えば、1,2を参照）ため、他の細胞内構造を支配する分子基盤を理解する重要な一歩を表しています。
プロトコル
1。 EMSトリートメント
シロイヌナズナの種子は、T /変異が5月7日にC / Gの結果ゲノムのC-to-T変化に誘導される変異剤エチルメタンスルホン酸（EMS）3,4、として使用して変異しています。
- 細胞小器官蛍光マーカー（具体的には、本研究ではssGFPHDEL（シグナル配列-GFP-HDELテトラペプチド）は、ERのマーカーとして使用されている）を運ぶ0.8グラムシロイヌナズナ種子（〜40,000シーズ）を量る。
- 50 mlのファルコンチューブに種子を譲渡し、25ミリリットルの蒸留水を追加します。
- 0.2％（v / v）のエチルメタンスルホン酸塩を追加します。
- 低速でミキサーをnutatingで16時間インキュベートします。
- 液体を吸引除去し、EMSを不活性化するために1.0 M NaOHを含むフラスコにそれを破棄します。
- 近くに、種子を含むファルコンチューブに25mlの水を追加し、5回反転の種子を洗浄するために、すべての種子が定着するまで待機し、その後1.0 Mナトリウムに水を吸引して捨てるフラスコOH。
- 最大10回まで洗浄工程を繰り返します。
- 最後の洗浄後、水の最小量の種子を再懸濁する。
- 10％の漂白剤の25 mLを加え、....
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ディスカッション
ここでは、内膜変異体の同定のための共焦点顕微鏡ベースのスクリーニングを説明しました。このアプローチは、簡単に特定の蛍光タンパク質マーカーが用意されているセルの他の器官に拡張することができます。画面は、ターゲット細胞小器官で、またはマーカーを含むことが想定されていない細胞小器官のいずれかに蛍光マーカーの異常分布を示す変異体の同定に基づいています。それぞれ、これらの変異体は正常細胞小器官の間でマーカーを転位することができませんマーカーをsubcompartimentalizeする細胞小器官の機能のいずれかが侵害されている集団や突然変異体を表しています。しかし、その他は開発の後期段階での表現型を示した。スクリーニングの間に我々はいくつかの変異体は発芽7日後には早くも開発の初期段階で表現型を示したことに気づいた。これは、変異の開発に依存した表現を含むいくつかの理由、にリンクされているかもしれませんが対立遺伝子（s）は、これは植物が潜在的に興味深い突然変異体が破棄されていないことを保証するために（少なくとも7〜14日）は、異なる成長段階で検討すべきであることを示唆している。
このプロトコルで.......
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開示事項
我々は、開示することは何もありません。
謝辞
我々は化学科学、地球科学とバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学、科学局、米国エネルギー省（受賞番号DE-FG02-91ER20021）と国立科学財団（MCB 0948584）（FB）の事務局のサポートを認める。私たちは、原稿を編集するためのMSカレン鳥に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| エチルメタンスルホン酸 | シグマ | M0880 | |
| NaOHで | JTベーカー | 3722から05 | |
| ムラシゲスクーグ培地ワットgamborgビタミン | フィトtechnolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | シグマ | P8169-1キロ | |
| RNeasyミニキット | キアゲン | 74104 | |
| マスター純粋な植物の葉のDNA精製キット | EPICENTRE | MPP92100 | |
| Bioprime DNAラベリングシステム | インビトロジェン | 18094-011 | |
| アルコール200プルーフ | デカンラボラトリーズ。 | 2716 | |
| NaOAc | JTベーカー | ||
| 遺伝子チップシロイヌナズナATH1ゲノム配列 | アフィメトリクス | 900385 | |
| ファルコンチューブ50 mLの | コーニング | 430290 | |
| エッペンドルフチューブを1.5 mL | |||
| 90ミリメートルろ紙 | ワットマン | 1001090 | |
| 化学てんびん | メトラー·トレドAB54-S | NA | |
| Nutating（波）シェーカー | Heidolph PolyMAXの1040 | NA | |
| 遠心分離 | エッペンドルフ5417-R | NA |
参考文献
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F.
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再版と許可
