Moxi Zミニ自動セルカウンターを用いた哺乳類細胞数、細胞サイズと細胞の健康の決定

サマリー

Moxi Zミニチュア自動セルカウンターは、特許取得済みの薄膜センサー技術とサイジングを実行するために、独自のソフトウェアアルゴリズムを使用して、粒子の幅広いサイズの範囲のカウントだけでなく、単分散の全体的な健全性を判断するコールター原理を組み合わせた斬新な楽器です哺乳動物細胞培養。このプロトコルは培養細胞の健康をカウントし、評価するための本器の使用方法について説明します。

要約

粒子および細胞の計数は、日常的な細胞培養、血液学的解析、工業的管理など、さまざまな用途に利用されています^1-5。細胞・粒子の計数技術における決定的なブレイクスルーとなったのは、50年以上前にWallace Coulterによって開発されたCoulter法でした。この手法では、ミクロンサイズの小孔に電場を印加し、単一の粒子を流体力学的に収束させて小孔を通過させます。粒子によって小孔が遮蔽されることで、電気インピーダンスに測定可能な変化が生じ、これが細胞のサイズや体積と直接的かつ精密に関連付けられます。このアプローチが細胞・粒子計数のベンチマークとして認識されているのは、特に手動法や画像ベースの技術と比較して、粒子のサイズ測定と計数の精度と正確性が極めて高いためです（Coulter計数器の正確度は約98%であるのに対し、手動および視覚ベースのシステムでは75-80%です）。これは、細胞計数への画像ベースのアプローチとは異なり、Coulter法が細胞や粒子の真の3次元（3-D）測定を行うためであり、細胞や粒子の正確な体積情報を算出することで、デブリや凝集による計数干渉を劇的に減少させることができます。全体として、これにより、他の計数技術よりも正確で、手間がかからず、時間を要さず、主観性の低い方法で細胞の数え上げとサイズ測定を行う手段が提供されます⁶。

細胞計数においてCoulter法は非常に重要ですが、従来の装置はコストが高く大型であるため、日常的な生物学的研究への普及には制約がありました。より安価なCoulterベースの装置も製造されていますが、2つ以上の細胞が同時に開口部を通過して測定される「コインシデンスイベント（同時計数）」の補正において、高価な装置に比べて性能に制限があります。既存のCoulter技術のもう一つの制限は、細胞サンプルの全体的な健康状態を評価する指標が欠けていることです。その結果、細胞の生存率を評価するには、Coulter計数に加えて別の手法を併用しなければならないことが多くあります。生存率評価の従来法では、細胞染色や、フローサイトメーターのような高価で煩雑な装置の使用が必要となるため、実験のセットアップ時間とコストが増大します。

本稿で説明するMoxi Z mini自動細胞カウンターは、クールの原理による精度と薄膜センサー技術を組み合わせた超小型ベンチトップ機器であり、使用する細胞計数カセットに応じて3-25 µmの範囲の粒子の精密なサイズ測定および計数が可能です。Mタイプカセットは、平均直径4-25 µm（ダイナミックレンジ 2-34 µm）の粒子計数に使用でき、Sタイプカセットは、平均直径3-20 µm（ダイナミックレンジ 2-26 µm）の粒子計数に使用できます。本システムは体積測定法を採用しているため、4-25 µmは細胞体積範囲の34-8,180 fLに、3-20 µmは細胞体積範囲の14-4,200 fLに相当し、これは非球形粒子を測定する場合に重要となります。Moxi Zを用いて哺乳類細胞の計数を行うには、まず計数対象の細胞をORFLOまたは同様の希釈液で希釈します。細胞計数カセットを装置に挿入し、サンプルのポートにロードします。数千個の細胞が、8-15秒かけて薄膜メンブレン内の「細胞センシングゾーン（CSZ）」を1列に並んで通過します。測定後、装置は独自の曲線フィッティングと専用のソフトウェアアルゴリズムを用いて、同時計数イベントの補正を行うとともに、目的の細胞集団の数と全粒子数の比率を決定することで、培養全体の健全性を評価します。全粒子数には、収縮した死細胞や崩壊した死細胞、およびその他のデブリや不純物が含まれます。結果は、自動曲線フィッティングを伴うヒストグラム形式で表示され、必要に応じてゲートを手動で調整することが可能です。

最終的に、Moxi Zは、現在のゴールドスタンダードであるCoulter Z2に匹敵する精度と正確さでのカウントを可能にすると同時に、培養の状態に関する追加情報を提供します。さらに、これらの結果をより短時間で、より省スペースで、操作とメンテナンスを大幅に簡素化し、同等の技術に比べてわずかなコストで実現します。

プロトコル

1。サンプルの調製

1. 細胞濃度は、測定器の動作範囲（3,000〜500,000細胞/ mLタイプMカセットの、またはタイプSカセットの3,000〜250万細胞/ mL）の範囲内であるようにORFLO希釈剤または適当な希釈剤で細胞懸濁液を希釈する。
2. 1:20〜1:5の希釈（タイプMカセット）、または1：05希釈（タイプSカセット）への希釈は、ほとんどの哺乳動物細胞株に推奨されませんが、適切な希釈は細胞の種類や播種密度に依存します。正確なカウントに必要な量は約75μLです。

2。実行サンプル

1. 電源ボタンを押すとホーム画面が表示されることにMoxi Zをオンにします。
2. トレイを押し下げて、Moxi Z. ピペット75μLサンプルにカセットを挿入します...画面が表示されます。
3. ピペットカセットの充填ポートに75μLのサンプル（青い楕円形の測定器に挿入されたカセットの端に応じて1または2）、標識した。これらは2つのテストに使用することができます使い捨てカセットです。注：プレース先端がウェルのフロントリップの下にキャッチされるように〜45°の角度でも直接ローディングピペットチップ。調剤するときは、カセットを入力するように空気のポケットを引き起こす可能性として真空流体の調剤の "出世"しないことが重要である。これは、調剤中にも上の流体の形の小さなビーズ（エントリのサイズも）を持っていることをお勧めします。
4. ほとんどの哺乳動物細胞を計数するため、開始するにはどこでも画面をタッチします。非常に小さい粒子（タイプMの4から8μmの平均粒径は、タイプS 3-8μmの平均粒径）をカウントするため、Moxi Zは小粒子のモードで実行することができます。注記：カセットの種類は、画面上部の黒いバーに表示されます。このモードでは、Moxi Zがデフォルトとしては2〜10μmの直径のスケールを設定し、カウントuを実行します。小さな細胞の検出のために最適化されたパラメータを歌います。 ここにタッチテストを開始し、このモードで実行する小さな粒子のモードボタン （黒い四角）を押します。
5. Moxi Zテストを開始し、細胞数の結果は、約8秒（タイプMカセット）、または15秒（タイプSカセット）で完了します。
6. カーブフィッティングとMVIの計算が自動的に開始し、わずか数秒で追加する必要があります。適切なフィットが見つかった場合、結果は、自動的に画面に表示されます。
7. ゲートのデフォルトの取得モードを作るために、ゲート·モードに切り替えるには、 カーブフィットカウントボタンを押してください。
8. この時点で、カセットユニットから削除することができます。

3。データの管理

1. 自動モードのスケーリングがオフになっている場合、結果は最初にカーブフィット2から34μmの直径スケール（タイプMカセット）のカウントまたは2月26日μに対して表示されますM（タイプSカセット）。 Automode（自動モード）スケーリングがオンになっている場合は、Moxi Zは、自動的にすべてのカーブフィットデータが表示されている確保しながら、カーブフィット人口の幅に近い範囲を横軸（x軸）にスケールします。
2. 自動モードのスケーリング、手動でより高い解像度で結果を表示するには、オフになっている場合は、2-26μmのアイコン（タイプM）または2月18日μmのアイコン（タイプS）をタッチします。注記：カセットの種類は画面の左上に青色のボックスに示されています。カーブフィッティング機能などだけでなく、視覚的にデータのニュアンスを識別するユーザの能力の両方を向上させるために小さな細胞または粒子をカウントする場合、これは推奨されています。
3. 水平解像度を増加させる時には、スケーリングのボタンをクリックすると、動的に利用可能なx軸の範囲の間にサイクリングを可能にするために調整されます：2から34、2-26、2-18、およびType Mカセット2-10ミクロン、または2 -26、2-18、およびType Sカセット2-10μmである。この機能は、毎日ご利用いただけます細胞数の直後にBLE。
4. カーブフィットまたはゲート領域のカウント情報は、（細胞/ ml）、ヒストグラムの左側の下に黒いボックスに表示されます。意味セルサイズ情報がヒストグラムの右側の下に黒いボックスに表示されます。
5. MVIの値は、ヒストグラムの右上にある青色のボックスに表示されます。テストは、小粒子モードで実行されている場合は、MVIは適用されませんと "MVI = SPM"と表示されます。細胞の濃度は、MVIの動作範囲の外にある場合はさらに、 "範囲のMVI = out"のメッセージが表示されます。
6. 現在のヒストグラムを保存するには、 完了アイコンをタッチします。このXXXは対応するテストの番号です "テストXXX"という名前のデータを保存します。
7. 手動でゲートにヒストグラムは、 カーブフィットのカウント結果のボタンを切り替えるには触れないでください。これはゲートのデフォルトの取得モードになります。その後ゲートを​​設定したり、目をタップする各青ゲートマーカーをスライドさせマーカーの間に微細なゲートを調整用の電子左と右の矢印（これらは青ゲートマーカーに触れない時に表示されます）セルのみがカウントされます。ヒストグラムの垂直スケールは自動的にカーブフィット人口の振幅に基づいてスケーリングされます。この垂直スケールを調整するには、ヒストグラム領域でスワイプは、画面を上下に動かします。
8. カーブフィットモードの表示に戻り、カーブフィットモードのデフォルトの取得モードを作るためにゲートのカウント結果のボタンをタッチします。
9. その結果を保存し、 ホーム画面に戻るには、 完了アイコンを押してください。結果を削除するには、恒久的にテストの結果を削除するには、いつでも削除]アイコンを押します。

4。以前に取得したデータの分析

1. 保存されたテストを開くには、 ホーム画面のヒストグラムアイコンを押してください。
2. 最大9つの保存されたヒストグラムのアイコンが画面に表示されます。興味のあるテストのために適切なアイコンを押すか、または複数のテスト結果を表示するにはアイコンがダウンPage Upキーまたは Page を押してください 。
3. 各ヒストグラムは、それが保存された方法に応じて、 カーブフィット·カウント·モードまたはゲートカウントモードのいずれかで開かれます。 ゲートカウントモードでは、ゲートマーカーは、それぞれ独立して青ゲートマーカーをスライドさせ、必要に応じて配置することができます。 オートゲートは、所望のピークに触れることによって。 ゲートカウントとカーブフィット·カウント·モードを切り替えるに触れないでください。
4. ヒストグラムの垂直スケールを調整するズームとUnzoomアイコンを押します。縦軸のスケールは、垂直に下に表示アップ（増加する）または（減少する）上で指をスワイプすることで変更できます。
5. 恒久的にテストの結果を削除するには、[削除]アイコンを押します。
6. に Doneアイコンを押してくださいテスト結果を閉じてホーム画面に戻ります。 （注：ズームビューが保存されません。）

5。 PCへのデータ転送

1. データは、PCまたはMacにMoxi Z USBケーブルを差し込むことによってOrfloのMoxichartアプリケーションを使用してPCまたはUSB転送経由で転送することができます。 Bluetoothの転送のために（MoxiChart）、最初のMoxi Zユニットのホーム画面のBluetoothアイコンを押すことにより、ユニットのBluetoothのIDを決定します。
2. コンピュータ上で、MoxiChartアプリケーションを開き、右上隅にあるBluetoothアイコンをクリックします。その後、Moxi ZのBluetooth IDに対応するデバイスを選択し、アップロードしたファイルの保存先フォルダを選択します。
3. Moxichartは、自動的にBluetooth接続を介して、指定したディレクトリにすべてのファイルを転送します。
4. ブルートゥース（MoxiChart）またはUSBで転送されたファイルが開かれ、analyすることができますそれらがフォーマットされているため、MoxiChartアプリケーションと直接アルファベットのゼットまたは。csvファイルは、直接それらをさらにカスタム/分析のために、Microsoft Excelや他のデータ解析プログラムで開くことができます。

6。代表的な結果

Moxi Zの精度と正確さを評価するために、0-500,000細胞からの範囲の濃度とHEK-293細胞、HeLa細胞、CHO-K1、酵母、ジャーE6-1細胞、PC12細胞、および高精度キャリブレーションビーズ懸濁液のカウント/ mLの（タイプMカセット）と0-2-2.5E ⁶細胞/ ml（タイプSカセット）をカウントし、すべての哺乳動物細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手したコールターZ2とMoxi Zを用いて比較したと前述した^7月11日として培養した。簡潔に、細胞をRPMI 1640（ジャーE6-1、PC12）、MEM（HEK-293、HeLa細胞）細胞、またはF12K（CHO-K1）細胞の核となるメディアと75ミリメートル²組織培養フラスコ中で懸濁液中で培養した。すべてのメディアは、を添加した10％ウシ胎児血清、100 U penicillin/100μgのストレプトマイシン。フラスコは、5％CO ₂で37℃インキュベーターで維持した。細胞は3日毎に継代した。酵母細胞（X5、C.アルビカンスは、Vin 13）は提供された直後に寄贈され、使用されました。タイプMのカセットのデータおよびタイプSカセットのために〜2-2.5E ⁶細胞/ mlの〜500,000個の細胞/ mlの初期サンプル濃度はコールターZ2を使用して確立されました。その後の理論的な濃度レベルは生理的なバッファ（ISOTON IIまたはハンクス平衡塩類溶液）で段階希釈により調製された。各濃度では、同一のサンプルは、両方のシステムで測定した、お互いに対してプロットした。 図2に示すように、すべてのサンプルのカウントの間に強い線形相関（タイプM R ^2> 0.9886、SタイプR ^2> 0.9781）がありました。濃度はまたMoxi ZとZ2の両方を持つ理論上の期待される/細胞濃度と比較した（ 図3）と再び強い線形相関（タイプM R ^2> 0.9758、SタイプR ^2> 0.9774）を示した。

精度を評価するために、HEK-293およびHeLa細胞数をコールターZ2、Moxi Z、および血球を用いて行った。 Moxi Z（タイプMカセット）、コールターZ2と血球を用いて細胞数の変動（CVは、n = 19）の平均係数はCVの20〜30万細胞/ mlの範囲内の5つの個別のカウントから測定して算出した。 Moxi Zの小さい平均CV（ 図4）は Z2のそれに匹敵するとコールターベースの計数技術を持つ唯一の達成精度の高いレベルの代表です。

Moxi Z機器のサイジング精度が購入した、高精度キャリブレーションポリスチレンビーズの測定により、次の評価を行った。 Moxi Zから平均粒径の測定（N = 5）は、メーカーに報告のサイズに対してプロットした。 iを見ることができるようにnは、図5に示すように 、Moxi Zの測定値は一貫して高い線形相関（r ² = 0.9989）とメーカーの値と一致していた。

サイズと数の情報だけでなく、Moxi Zが報告されたMoxi生存率指数（MVI）の値を持つ哺乳動物細胞培養の健康の試薬フリー、一般的なアセスメントを提供しています。このインデックスは、総微粒子数に関して興味のある集団の細胞数の比から生成されます。 MVI測定機能を実証するために、MVIの測定値（タイプMカセット）は、標準マニュアルおよびフローサイトメトリーLIVE / DEADの測定技術と比較した。死んだ（<10％生存）HEK-293、HeLa細胞の集団は、37℃希釈剤（ISOTON II、ベックマン·コールター）を含む栄養フリー、フッ化ナトリウム℃で生きている細胞の一晩インキュベーションを介して作成された制御理論的な可能性のレベルは、レシオメトリック生細胞と死細胞の既知濃度を混合することにより調製した。解像度ultingソリューションは、血球数、フローサイトメーター測定の両方で重複しての生存率のレベルを分析した。血球の測定は、0.1％トリパンブルー溶液と細胞の伝統的な50/50混合物を用いて行った。フローサイトメトリーの測定はViacount試薬とメーカーが指定したプロトコル（メルク）を使用して、グアバPCAメーター（メルク）を用いて行った。 図6に示すように、HEK細胞とHeLa細胞"の類似した血球の生存率にMVIデータの線形フィットの" Pearsonの相関係数の値は（R ^{2）R 2}はそれぞれ= 0.9937とR ² = 0.9728であった。これらの結果は、このアプローチは、フローサイトメトリーまたは血球計算板を用いて得られたLIVE / DEAD測定に好意的に比較し、細胞生存率の広い範囲にわたって文化の健康情報を提供することを示している。

テーブルとフィギュア（Dittami ら 、2011年から^。）15：

図1。薄膜コールター計数：電気電流が薄膜カセットのセルセンシングゾーンを介して渡されます。細胞がCSZを介して単一のファイルをフローとして、電圧の瞬間的な増加はMoxi Z.によって測定される

図2。 Moxi Zカウントは Moxi Zカウントのカウント値（N = 3-4）に対してプロットした平均化コールターZ2カウントに匹敵しています。細胞とビーズ懸濁液の同一カウントコールターZ2とMoxi Z.の両方を使用してカウントしたコールター対応Z2数と線形近似のR ²値が決定した。 A）タイプMカセット - 0の濃度範囲 - 500,000細胞/ ml。 B）タイプSカセット- 0の濃度範囲- 2 2.5E ⁶ / ml.Errorバーが示す±1標準偏差を。

図3。 Moxi Z濃度の測定対理論上の細胞濃度。 A）タイプMカセット-理論濃度値を初期500,000個の細胞/ mlのサンプルの連続希釈液から調製したB）タイプSカセット- 2.5E ⁶細胞/ mlのサンプル-理論濃度の値は、2つの初期の段階希釈から調製した。エラーバーは±1標準偏差を示しています。

図4。コールターZ2、Moxi Z（タイプMカセット）と、血球の変動係数。HEK-293と、各アプローチのHeLa細胞数の変動の平均係数（CV、N = 19）が、別の5から測定したCVSを使って計算した20万でHEK-293、HeLa細胞のカウント - 300,000細胞/ mlの範囲。エラーバーは±1標準偏差を示しています。

図5。 Moxi Z-Moxi Zを使用した粒径測定の精度は、ビーズの大きさを測定した（タイプMカセット）対メーカーは、ビーズの大きさを報告した。エラーバーは±1標準偏差を示しています。

図6。 MVIを用いて培養健康評価-血球計算板を用いた視覚、トリパンブルーのステンド生存カウント対MVI測定（タイプMカセット）とグアバPCA Viacount生存率の比較。

ディスカッション

基礎となる実装は、コールターのアプローチは、測定の全体的な精度の高い決定論的なことができます。重要な領域は、2つ以上のセルが同時に開口部を通過し、単一の電気のイベントとして測定される "偶然のイベント"の生細胞数の補正である。 "偶然のイベントは"セルサイズとクラスタリングの程度（Davisら^1967）6を含む多くの要因によって異なりますエラーに貢献しています。結果として、任意のサンプルに必要な一致補正は広く細胞/粒子型の間でも同一の細胞型の異なる文化の間で変化させ、予測することはできません。コー​​ルター社の初期の出版物に根ざした理論を確立し、観測された出来事と経験的に決められ、粒子固有の補正係数、zの数に基づいて、生のカウントの対数調整を適用することを意味する。正確なカウントが正しくトンを達成することができますが、自分の補正アルゴリズムは、それは細胞の種類と正確にその値を予測する上で対応する難しさとの間のz値の大きな変動に起因する、その実用性が制限されています。ここで、偶然の補正アルゴリズムと組み合わせてMoxi Zカーブフィッティングによって識別された "真の"セルの数を使用して、Moxi Zは、動的に真の濃度を達成するために偶然を補正します。 500,000個の細胞/ mlの（タイプMカセット）、3000 - 2 - -2.5E ⁶細胞/ ml（タイプSカセット）ハイエンドコールターZ2を使用して得られた結果と比較すると、Moxi Zが0の濃度範囲にわたって同等のカウントを生成する。さらに、Moxi Zはカウントの変化と同様の係数が低いと、金本位制、細胞計数にコールター·技術の特徴である粒子サイジングの精度で、このカウント精度を実現しています。

また、ここで提示されたデータはMoxi Zは貴重な情報を提供することができることを示し細胞培養の全体的な健康に関する。 Moxi Zは、この培養健康診断を決定するために独自のソフトウェアアルゴリズムを使用してカーブフィッティングアプローチを活用しています。このような離れて壊す、ブレブ形成などの細胞死に関連付けられている形態学的変化、および体積歪（片岡鶴、1996年Lieglerら、1995、シェリダンら^{1981）12月14日は} 、それが可能Moxi-Zの間impedimetricの違いを区別するために作る集団と死細胞/残骸集団住んでいます。 MVIは、粒子の破片、縮んだ壊死細胞、および利息のカーブフィット細胞集団の相対的な寄与を識別するために、文化/粒子サイズ分布を解析することによって生成されます。 MVIの値は、それによって全体の粒子集団のプロファイルに関して単人口数の人口インデックスまたはレシオメトリック測定を反映しています。次に、この値は、アルゴリズム、調整ベースの人口統計と経験的な観察である。 Becaus電子MVIは、伝統的な染色のアプローチ以外のパラメータを見て、それはこれらのテクニックをミラーリングすることが期待ではなく、細胞培養の健康に貴重な代替ビューを提供し、特に破片や微生物の汚染に関してされていません。

要約すると、Moxi-Zセルカウンターは、コールター原理と特許取得済みの薄膜センサー技術と組み合わせてカーブフィッティングソフトウェア·アルゴリズムを使用して、セル数、セルサイズ、セルの健康の正確な、再現可能なアッセイを提供する超小型のベンチトップ測定器です。 8秒で、 - 直径25ミクロン（34ミクロン2のダイナミックレンジ - ）タイプMカセットでは4に至るまでの粒子を計数することが可能です。 15秒で、 - 直径20ミクロン（26ミクロン2のダイナミックレンジ - ）タイプSカセットでそれは3つに至るまでの粒子を計数することが可能です。さらに、Moxi-Zは、試薬を使用せずに健康診断を行います。それははるかに少ない労働積分ですnsiveとマニュアルカウントよりも主観的。標準コールター計数と比較して、Moxiは、大幅に小さく高速で、より多くの情報を提供するかなり少ないメンテナンスを必要とし、使用する方が簡単で、コストのほんの一部です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ORFLO希釈	ORFLO	MXA006
カセットディスペンサー	ORFLO		便利な調剤のための25カセットまでの店舗
USBケーブル	ORFLO		PC / Macまたは電源アダプタに機器を接続する
電源アダプタ（米国およびEUのモデルのみ）	ORFLO		USBケーブルは、ACコンセントに接続します
USBフラッシュドライブ	ORFLO		店舗モックス私はZのソフトウェアおよびユーザーマニュアル
キャリブレーションチェックビーズ	ORFLO
電子校正カセット	ORFLO		適切なシステム動作とキャリブレーションを検証するための電子カセット