方法論記事

ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

DOI：

10.3791/3872

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2012年4月13日

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1Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine

この記事について

サマリー

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内皮コロニー形成細胞（ECFCs）組み込み表示されていること、堅牢なクローン増殖能と血管内皮細胞を循環している船が能力を形成する。 CBから派生した副産物内皮細胞の表現型および機能解析を識別し、分離することが重要です。善意 ECFCs。

要約

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血管新生、脈管形成、および動脈形成を介して新しい血管の形成の長年のビューは、最近1日されています。内皮前駆細胞（EPC）の循環の存在が最初に麻原らが成人ヒト末梢血で同定された1997年2血管の再生と修理のための新しい仮説と戦略の注入をもたらすインチEPCは血管形成または血管リモデリングのサイトへのホームという血液の循環まれではあるが、通常のコンポーネントであり、主にセル3派生した既存の血管壁のパラクリン刺激を介して出生後の脈管形成、血管新生、または動脈形成のいずれかを容易にします。 EPCを識別するために、特定のマーカーが同定されず、フィールドの現時点での状態は、血管新生、造血幹細胞や前駆細胞を含め、その多くの細胞タイプを理解することであり、新生細胞、Tie2の+単球、骨髄前駆セルを循環されていますlsは、腫瘍関連マクロファージ、M2活性化マクロファージは、前臨床動物モデル系の様々な、多くの病気の状態4、5、人間の被験者の血管新生のプロセスを刺激するに参加しています。内皮コロニー形成細胞（ECFCs）堅牢なクローン増殖能、播種時に能力を形成する第二級および第三級コロニー、および免疫不全マウスへの移植時に6月8日 in vivoで血管内に本質的な形成する能力によって特徴付けまれな循環可能な内皮細胞である。 ECFCsが正常健康成人被験者、健康な新生児の臍帯血（CB）、および多数の人間の動脈および静脈の血管6-9の血管壁の末梢血から単離されているが、CBはECFCs 7の最高周波数を有していることを表示最も堅牢なクローン増殖能および in vivo 8、10-13 のフォーム耐久性と機能的な血管を。 whileの導出成人の末梢血からECFCここでは、我々が導出するための方法論を記述し、14、15を提示されており、クローニング、拡張、およびin vitroで同様にヒト臍帯CBからECFCs の in vivo特性のように 。

プロトコル

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試薬およびソリューション

EMG-2メディア（ロンザ、カタログ番号CC-3162 EBM-2培地とEGM-2 SingleQuotキットサプリメント＆成長因子を含む）

全体SingleQuotキットサプリメント＆成長因子（ロンザ、カタログ番号CC-4176）、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）を添加したEBM-2（ロンザ、カタログ番号CC-3156）と1％（v / v）のペニシリン（10,000 U / ml）を/ストレプトマイシン（10,000μg/ ml）を/アンフォテリシン（25μg/ ml）を。 4℃で1ヶ月まで保存限りECFCのカルチャで使用するための推奨EGM-2ボリュームは、500μl/ウェル、24ウェルプレート用、2ミリリットル/ 6ウェルプレート、5ml/25-cm 2つのフラスコ、10 ml/75-cm 2フラスコのためのものですそうでないプロトコルで指定された。

コラーゲンI溶液

の滅菌蒸留水495ミリリットルの氷酢酸（17.4N）（0.02 N最終濃度）の0.575ミリリットルを希釈します。滅菌フィルター掃除機0.22-μmの希酢酸uumのろ過システム。 50μg/ mlの最終濃度まで希酢酸に25 mgのラット尾コラーゲンIを追加します。コラーゲンの量....

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ディスカッション

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推定される内皮前駆細胞の表現型および機能解析は、クローンと連続して再メッキ文化の中で可能である善意の ECFCsを識別し、in vivoでの耐久性と機能的な植込み型血管を生じさせることが重要です。ヒト臍帯血はECFCsと老化や病気の10のこれらの循環細胞の減少の濃度で濃縮されています。最近の研究では、ECFCは、血管損傷、心筋梗塞、網膜症17から19までの状況では、血管の修復や再生に重要な役割を果たすことを示唆している。

ここでは、拡張、およびin vitroで同様にヒト臍帯CBからECFCs の in vivo特性評価では、クローニング、導出するためのシンプルかつ効率的な方法論を説明してきました。これらのアプローチは、研究者がクローン増殖能を持ってCBからの善意のEPCを識別し、分離するために有効にして、 in vivoでの血管形成能インチ

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開示事項

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利害の衝突が宣言されません。

謝辞

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博士YoderはEndGenitor Technologies社とRimedion Technologies社の取締役会のメンバーへのコンサルタントです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号
ヘパリンナトリウム注射液、USP APPファーマシューティカル 504031
フィコール - Pague アマシャムバイオサイエンス 17-1440-03
ミキシングカニューレマースク医療 500.11.012
EGM-2 ロンザ CC-3162
定義されたFBS ハイクローン SH30070.03
TrypLE急行ギブコ 12605
ラットI型コラーゲン BDバイオサイエンス 354236
マトリゲル BDバイオサイエンス 356234
FcRをブロックミルテニーバイオテク 130-059-901
hCD31、FITC抱合テッド BD Pharmingen社 555445
hCD45、FITCコンジュゲート BD Pharmingen社 555482
hCD14、FITCコンジュゲート BD Pharmingen社 555397
hCD144、PEコンジュゲートベイバイオサイエンス 12-1449-80
hCD146、PEコンジュゲート BD Pharmingen社 550315
hCD105、PEコンジュゲートインビトロジェン MHCD10504
MSのIgG 1、K抗体、FITCコンジュゲート BD Pharmingen社 555748
MSのIgG 1、K抗体、PEコンジュゲート BD Pharmingen社 559320
MSのIgG 2aは、K抗体、FITCコンジュゲート BD Pharmingen社 555573
抗ヒトCD31 Dako社クローンJC70 /
アンチ覚書電子CD31 BD Pharmingen社 553370
0.22-μmの真空ろ過システムミリポア SCGPU05RE
氷酢酸、17.4N フィッシャー A38-500
抗生物質抗真菌インビトロジェン 15240-062
ウシ胎児血清（FBS） ハイクローン SH30070.03
IHC亜鉛固定液 BDバイオサイエンス 550523
SYTOXグリーン試薬インビトロジェン S33025
滅菌クローニングシリンダー、 フィッシャー·サイエンティフィック 07-907-10

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  2. Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  3. Urbich, C., Dimmeler, S.

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