イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

サマリー

等速電気泳動（ITP）は、毒素の検出からサンプル調製に至るまでのアプリケーションで堅牢な電分離と濃縮技術です。小分子および細胞培養溶解液からの核酸の精製の分離と検出：我々はITPと2具体例のアプリケーションにこのテクニックを適用する方法論の物理的原理を確認します。

要約

電技術があるため可動部分のない、シンプルでコンパクトなシステムでは、流体および電気泳動プロセスのさまざまな操作を実行する独自の能力のマイクロアプリケーションの主食です。等速電気泳動（ITP）は、イオン移動度に基づいて百万倍濃縮^1,2、および効率的な分離と抽出を実現することができ、シンプルで非常に堅牢な電テクニックです。たとえば、我々は分離と非標識の高感度検出にITPのアプリケーションを実証した³ほとんど、またはまったくサンプルの準備^4月8日とし、細胞培養、尿、血液などの複雑なマトリックスからの核酸の抽出と精製にイオン分子（例えば、毒素、DNA、リボソームRNA、miRNAを^{）。9月12日}

ITPは、焦点と流体チャネル·システム内に印加される電界と2つのバッファを用いて分離を実現しています。アニオン性の検体については、主要な電解質（LE）バッファが選ばれているその陰イオンとしてPersat らによって詳細に説明し、後続の電解質（TE）バッファー（実効移動度はイオンの観測ドリフト速度を説明し、アカウントへのイオンの電離状態をとり、の陰イオンよりも高い効果的な電気泳動移動度を持っているUCH ^13）。 TEとLE間のインタフェースを確立した後、電界は、LEイオンはTEイオンが占有する領域から離れて移動するように適用されます。先にTEイオンの中間の効果的なモビリティのレースのサンプルイオンがLEイオンを追い越すので、それらはLE-TEインタフェース（以下、 "ITPインターフェース"と呼ばれる）でピント合わせはできません。さらに、TEとLEは、ITPのインタフェースで急な電場勾配を確立し、それぞれ低域と高導電性の領域を形成します。彼らは焦点としてこのフィールドの勾配は、サンプル種をpreconcentrates。適切な他の非焦点を当てた種から焦点を当て、対象種の精製におけるTEとLEの結果の選択と、最終的には、分離サンプル種のd分離。

ここではITPの基礎となる物理的な原則を確認し、2つの動作標準モードについて説明します。 "ピーク"と "高原"モード。ピークモードでは、比較的サンプルイオンがITPインターフェイスで狭いピークが重なっ内で一緒に焦点希釈します。高原モードでは、より豊富なサンプルイオンが定常状態の濃度に達するとその実効移動度順に並べられ、隣接する台地のようなゾーンに分離する。ピークと高原モードでは、同じ基礎となる物理学の外に発生するが、最初の分析対象成分の濃度および/またはサンプルの蓄積のために割り当てられた時間の量によって区別異なる制度を表しています。

我々は、最初に詳細にモデルのピークモードの実験を記述し、E.からの核酸の抽出のためのピークモードアッセイを実証する大腸菌の細胞培養。我々は分離を可視化するために、非焦点トレーサー（NFT）種を使用する場所、高原モードアッセイを提示することによって、単位および結論アミノ酸の定量を形成しています。

プロトコル

1。 ITPの物理

ITPのような電荷のイオン間の鮮明な移動境界を形成します。技術は、アニオン性又はカチオン性のサンプルで実行されますが、我々は調整するが、このアニオンITPへの導入と注意同じ原則は、カチオン性ITPに適用することができます。我々はLEイオンが高い大きさの効果的な電気泳動移動度を持つようLEおよびTEバッファを選択します。効果的な電気泳動移動度、μ= U / Eは 、印加電界の間で比例定数、E、およびイオンドリフト速度、Uは¹³我々は、LEとTEの間に拡散界面を確立し、高から指示電界を印加する低導電率TEゾーンへの導電性LEゾーン。システムはすぐに不均一な導電率プロファイルに起因するITP界面での電場の強い勾配を確立します。その名の通り同じ、均一VEで、TEとLEイオンの旅（ギリシャ語から、 "ISOイメージ"は "takhos"は "速度"を意味し、 "等しい"を意味します）locityは、不均一な電場と電流の保護の結果として（これはいわゆる"ITP条件"であり、 図1を参照）。

ITPインターフェースが自生されています。TEゾーンでの経験に強い復元する磁束を拡散し、主要なゾーン（LEゾーンのTEイオンの逆）に返すことLEイオンを。試料イオンは、TEゾーン内のそれらの効果的なモビリティがTEの共イオンのものよりも大きい場合は、このインターフェイスに焦点を当て、LEゾーン内のそれらの実効移動度はLE共同イオン（ 図1参照）のそれよりも小さい場合。 ITPの特性は、この手法の頑健性に貢献し、インタフェース（例えば幾何学における圧力駆動流れや変化により、そのような収縮、拡張、およびオフなど）の障害にITPは比較的鈍感で作る自生して焦点。

ピークモードITP（ 図2aとビデオ1-2を参照）では、試料イオンの濃度は、すべての回でLEおよびTEイオン濃度よりも有意に低いため、地元の電気伝導度に無視貢献しています。試料イオンの分布は、隣接するゾーン間自生インタフェース（ここではTEとLE）と、これらのゾーンに対するサンプル実効移動度の値によって決定されます。大部分¹⁴として、複数のサンプルのイオンは同じ狭いITPインターフェースの領域内に集中ピークが重なって。インタフェースとピーク幅と同様に、関連付けられている濃縮係数、印加電流に反比例します（ 図2bの実験を参照してください^）14。

十分に高い初期サンプル濃度と十分な蓄積時間については、試料イオンは、しきい値の濃度値に到達します。完全にイオン種は、この値はコールラウシュの調節機能（KRF）によって決定されます。弱電解質^15は 、それはAlbertyとJovin関数によって決定されます。高原で^16,17モードは、 図3と試料イオンは、その実効移動度によって決定されるために、局所的に均一で一定濃度のゾーンに分離して浄化するビデオ3に示す。非常に希薄なイオンは依然として高原ゾーン間のピークモードに焦点を当てることができます。 ITPにおいては、試料イオンは、TEとLEの間に有限の注入で導入することができます（ 図3を参照）、または交互にTE、および/ ​​またはLE（ 図2参照）と一緒に混合した。我々は継続的に分析対象物イオンを蓄積するために使用することができ、 "半無限"注射として、TEゾーン内の混合を参照してください。連続サンプルの蓄積がピークと高原モードアッセイの両方に感度を向上させます。しかし、有限の注射は高原モードではより一般的である。半無限注入で高い初期検体の濃度が実質的にTE導電性と低い焦点率を高めることができるので、これは可能性があります。また、完全な浄化がrema以来、半無限注入（では不可能です。プラグTEにおける有限濃度）。

2。デバイスのクリーニングと準備

このプロトコルで提示アッセイのために我々は、クロスチャネル·デザイン（ 図1を参照）等方的に（およそD型断面）ウェットエッチングガラスマイクロチップを使用しています。以下のクリーニングと準備プロトコルは、ホウケイ酸塩と溶融シリカチャネル用に最適化されていますが、ガラス/ PDMSチップでも使用することができます。電気浸透流（EOF）を抑制するために必要なダイナミックコーティングの再現性と成功したアプリケーションを実行する - は、実行することを確認する前の実験にこの洗浄手順を実行します。このプロトコルの省略は、ITPインターフェースの強力な分散をもたらすかもしれません^14。

1. チャンネルを浄化するために、10％の漂白剤の10〜20μLと北、東、南貯水池を記入し、2分間西部貯水池で真空を適用します。標準キャリパーチップキャディーを使用している場合は、真空を効果的に単にattachinによって適用することができますグラム全体の200μLの終わり（フィルターなし）チップ貯水池にピペットチップおよび2ミリメートル内径チューブに真空ラインを接続します。
2. 空の貯水池と2分の1 M水酸化ナトリウムチャネルを（ステップ1のように）すすいでください。これは、優しく均一な表面特性を確立するためにクリーンなホウケイ酸塩の表面を得、チャネル壁を削り取る。
3. 貯水池は空と脱イオン水（DI）、クリーン、その後約2分のLEでチャネルを洗い流してください。この期間中の表面特性と動的なコーティングは、チャネル内で平衡化します。

3。ピークモードITPに焦点蛍光体

1. 100mMの塩酸、200mMのトリス、1％PVPから成る1 mLのLEを準備します。
2. 100mMのHEPES、200 mMのトリスから成る1 mLのTEを準備します。 1μMのAlexa Fluor®488（AF488）の10μlを90μlのTEを兼ね備えています。
3. パート2に記載されているLEで洗浄した後、空の西の貯水池とDIとの数回の清掃やタンクに残っているLEを希釈するファンデ。 AF488を含む20μLのTEでこのタンクを埋める。
4. 東貯水池の正極と西貯水池のグランド（マイナス）電極を配置し、2μAを（定電流）に適用されます。サンプルのピークが西から東貯水池貯水池へ一定速度で移行されます（図1を参照）と低い導電性TEは、チャネルを埋め、これらの貯水池の間の電圧が増加します。

4。培養されたE.からの核酸の抽出と精製大腸菌

選択的イオン種を集中する能力は、生物試料準備のための理想的なテクニックをITPになります。我々は実効移動度の大きさの標的核酸よりも低いが、CO-イオンのPCR阻害剤（例えば、アニオン界面活性剤、タンパク質、有機溶剤、たとえハワイ州で現在よりも高いと末尾の陰イオンを選択することにより、未処理の細胞溶解液から核酸を精製するGH濃度）。カチオン性PCR阻害剤（例えば、アルカリ金属およびカチオン性タンパク質と界面活性剤）が反対方向に移行し、今も残されています。 （ 図4を参照）の後ろに遅いPCR阻害種を残したまま、ITPは、サンプルリザーバーから標的核酸を抽出し、重点を置いています。

1. のサンプルや文化E.を取得します。 10 ⁸ CFU / mL以上の密度に大腸菌細胞。
2. 6分間4000グラムで遠心分離して安全なロックの微量遠心管とペレットに1 mlの細胞培養を転送します。
3. 80μLRNaseフリー水でペレットを再懸濁および10mMトリシン、10mMのビス - トリス、2mMのEDTA、0.1％トリトン-X、および5 mg / mLのリゾチームから成る剤を溶解し、10μLを追加します。穏やかに混合し、5分間インキュベートします。室温（Bercovici らから適応溶解プロトコル^11）。
4. 〜12.5溶解液のpHを上げるために1 M水酸化ナトリウムの10μLを追加します。静かにピペットを作動させるとダウンするまで、解決策は、溶解が完了した時点で、明確になります。
5. 50mMのトリシンの90μLおよび100mMビス - トリスで溶解液の10μLを兼ね備えています。このソリューションは、現在、TEとして使用することができます。
6. 500mMのビス - トリス、250 mM HClで、1％PVP、および1XのSYBR Green IIで構成されたLEの1 mLを準備します。 パート3で説明したようにLEとマイクロ流体チップを埋める。
7. ITPは、次のオフチップ·分析のために精製された核酸を抽出するために、50mMのビス - トリス、25 mM HClで、0.1％PVPを含むPCR-互換性のあるLEで東貯水池の内容を置き換えます。実験を開始し、東と西の井戸の間で1000 Vを適用します。これらの貯水池の間に電流が減少します。
8. 実験の最後にサンプルはLEリザーバーに溶出する。この溶出と一致し、このシステムの現在の対時間は、通常、プラトー値（抵抗値は現在均一チャネル内に分散しTEイオンによって支配されているため）に達する。穏やかに貯水池を混在させるによって内容がピペッティングを繰り返し、定量的RT-PCR法による分析のために5μLボリュームを抽出します。

5。可視化のためカチオン高原モードITPと非焦点トレーサー（NFT）とアミノ酸の分離

ITPは、TEとLEの間に隣接していると検出可能な台地に小さなイオンを分離し、集中することができます。これは、地元の導電性、UV吸光度、温度センシング、または屈折率などの物理化学的性質に基づいて、検出および識別することができます。ここでは、蛍光、共イオン種がLEに追加され、非焦点トレーサー（NFT）アッセイを示しています。この蛍光種が集中していませんが、その濃度は局所的な電界に適応し、その結果（ 図5を参照）精製された高原ゾーンの可視化を可能にします。

1. 100mMのエタノール、200mMのトリシン、1％PVP、およびカチオン性蛍光体のローダミン6Gの100μMから成る1 mLのLEを準備します。
2. 準備1 mLのTEは、20mMトリス、40mMのトリシンで構成されています。 10μLの50 mMアルギニンおよびリジンの50mMの各々TE 90μLを混合して試料を調製する。
3. 東貯水池の西と北の貯水池とサンプル20μLLEを分注する。 1分間南貯水池で真空を適用します。
4. DIとよくイーストをすすぎ、TE（サンプルなしでTE）に置き換えます。
5. 東と西の貯水池の間に500 Vを適用します。

6。代表的な結果

我々は、 図2bと図4の核酸抽出実験ではピークモード実験のisotachopherogramsを示しています。蛍光レポーター（例えば、AF488、SYBRグリーンII）とピークモードの実験では、全体の蛍光強度を定量的な濃度情報を取得するために較正曲線に対して統合され、比較することができます。さらに¹²核酸抽出実験では、サンプルは溶出を許可されているtに彼LEタンクと定量的RT-PCRにより解析するためのピペットで抽出した^。10,12我々は図5のアミノ酸を分離するために高原モードisotachopherogramsを示しています。ゾーンの幅は定量を有効にしながら蛍光強度は、（LEまたはTEゾーン強度に対する相対的な）、ゾーンの識別に使用することができます。

図1：等速電気泳動（ITP）は、イオンの高感度な検出と分離のためのマイクロ流体アプリケーションで使用される電技術です。 ITPは、分離、選択的な焦点を当て、濃縮機能を提供します。さらに、それは非常に堅牢であるため、その自生自然の物理的な障害には区別されません。試料イオンを選択的にリードする（LE）とLEゾーンの主要なイオンの速度によって決まり、一定速度で流路を介して電解液（TE）と旅行末尾の間に集中。試料イオンその効果的な電気泳動移動度はLEおよびTEイオンの実効移動度で囲まれている場合、フォーカス。回路図は、サンプルはLEおよびTEゾーン間で連続的に焦点を当て、モデルITP実験を示しています。

図2： "ピークモード" ITPにおける試料イオンフォーカスを希釈します。 ）は、2つの異なる希釈（C _サンプル << C _LE）LEおよびTEゾーンとの間に形成されたインタフェースでのピークモードでの種に焦点を当てています。サンプル種は電流を大幅に寄与しないとしてのみLEおよびTEは、電界を決定します。試料イオンは、TE（半無限注射で）と混合しており、ITPの界面でほぼガウスピークで一緒に焦点を当てる。焦点の基準は、（不等式で示される）を強くイオン種に適用されます。 B）のAlexa Fluor 488を示 ​​す実験（AF488）が適用された電流（またVを参照の範囲のピークモードに焦点を当てIDEO 1）。サンプルピークの幅は、（電気浸透流による移流分散は無視できる）の電流に反比例します¹⁴自生インタフェースは圧力駆動流による分散（ ビデオ2を参照）に耐性があります。

"高原モード"で十分に高濃度のフォーカスで図3のサンプルイオンと地元の導電性を制御します。我々は、通常、TEとLEの間に有限の注入でサンプルイオンを紹介します。その効果的な電気泳動移動度（ ビデオ3を参照）に従って、この様式では、試料イオンは、独立したため。強くイオン化された種については、TEと高原ゾーンの濃度はコールラウシュの調節機能（KRF、LEゾーンで最初に不変集合）によって決定されます。希薄なイオンは高原ゾーンブラケットその効果的なモビリティの間にピークモードでピントを続けています。 cを中心にriterionは（不等式で示される）を強くイオン種に適用されます。

図4は、ピークモードITPでの準備と核酸抽出をライセート。核酸は、E.から抽出されリゾチームアシストアルカリ溶解を使用して、ITP を経由して中心に選択的な電気泳動により精製し、大腸菌の細胞培養。ライセート（茶色）と混合したTEは、標的核酸（緑）、タンパク質、および潜在的なPCR阻害化学物質を含んでいます。背後にPCR阻害物質を残したまま、後続および先行イオンの適切な選択は、標的核酸の焦点選択できます。はめ込み画像でここに示すように全核酸ITPのピークは、しばしば、非理想的な形になります。このアッセイのデモンストレーションとして、我々はグラム陰性菌から全核酸を抽出し、ITPを使用して、 大腸菌 （単独水酸化ナトリウム溶液で溶解）、溶解液から精製されたNAは、収集した遺伝物質を抽出し、細菌の培養液からの16S rRNA（赤）と16S rDNA塩基（緑）の成功した精製を検証するために定量RT-PCR解析を行った。 16S rRNA遺伝子（青）と16S rDNA塩基（黄色）の負の制御しきいサイクルは、それぞれの上記の30サイクルであった。我々は、 電源のSYBR Green RNA-に-C _Tの推奨サーマルサイクリング条件で150前方にNM（5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG）とリバース（5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC）プライマーを用いて、アプライドバイオシステムズからの1ステップはキットを使用して 、定量RT-PCRを行った。

図5非標識アミノ酸の分離と検出のための非焦点トレーサー（NFT）アッセイ。 NFTアッセイの1）の回路図。試料イオンの有限注入はイーストチャネルに導入されています。我々は、TEイオン（μ _{トレーサー<μTE）}より低い実効移動度を持つトレーサーカチオン性フルオロフォアでLEを混ぜる。フルオロフォア"underspeedingトレーサー"として機能するように言われています。蛍光団は、現在サンプル高原とTEによって占有ゾーンにLEからelectromigratesとして、それはより高い電界、したがって、その濃度の増加が発生します。濃度の変化はisotachopherogramの手順を作成します。 b）の二つのアミノ酸、アルギニン、リジン、の分離underspeeding蛍光トレーサーとしてローダミン6GとNFTアッセイを使用します。 TEとアルギニンの間にわずかなピークが、ITPで一般的によく理解されていない、ここで高原を検出又は定量を妨げることはありません。

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ディスカッション

ITP法は、迅速に敏感な、堅牢な検出およびイオン分子の処理を有効にするここで提示した。 ITPを使用する際の主な課題は、LEおよびTEバッファの適切な選択です。それは非常に高い絶対的な移動度を持つ強さの酸であるため、非常に予測可能な性質を持っているのでアニオンITPで、我々は一般的に主要な陰イオンとして塩化物を選択します。従って、アニオン性ITPのバッファの選択は、通常、適切なTEと対を選択することに低減されます。選択的な焦点の実験では、TEの選択は、汚染イオンの排除に重要です。汚染物質が存在しないアプリケーションでは、低TE実効移動度は、焦点の速い速度につながります。 MES、MOPS、HEPES、トリシン：我々は相対的にアニオン性のTEイオンを行儀には、次の手順を使用することをお勧めします。対イオンの選択は、システムのpHとTE効果的なモビリティの両方に影響を与えます。一般的な対イオンは、トリス（pKaは8.1）、ビス - トリス（pKaは6.4）です。低い、または高いpHを必要とするアッセイのために、我々はピリジン（pKaは5.25）をお勧めしそれぞれエタノールアミン（pKaは9.5）。 表1と表2に、アニオン性およびカチオン性ITPに対して、それぞれ、我々はいくつかの有用な緩衝液の例をまとめたものです。我々は、カチオン性LEイオン等のアニオン性LEイオンとナトリウムと塩酸を取り、我々はLEバッファー100 mMのイオン強度を想定しています。

読者は、私たちのプロトコルのバッファイオン強度（および表1-2）は、常により大きいまたは10 mMに等しいであることに注意します。理論的にITPの物理学が10mMより低いイオン強度で適用されますが、1 mMのレベルに近い自然な汚染物質（水や大気中の二酸化炭素との反応から、例えばカルボン酸）は、しばしば低イオン強度バッファーの実際の使用を制限します。

我々はシグナル伝達機構は、このプロトコルで提示アッセイに限定されないことに注意してください。パート5で簡単に説明したように、高原モードで精製したゾーンは、ローカル伝導率の変化は、UV absorを介して検出することができます屈折のbance、温度、またはインデックスです。私たち自身のグループでは、我々は、未知の分析対象物質の高感度な検出と識別のための蛍光灯のキャリアアンフォライトを利用する方法を開発しました。ピークモードの実験では^{図5に示すように} 、特定のプローブが焦点を当てた分析対象物にラベルを付けるために使用することができます。高い特異性で標的DNAまたはRNA分子を検出するために^11,18を -彼らの標的配列にハイブリダイゼーションの際に蛍光オリゴヌクレオチドプローブ-一実施例では、我々は、分子ビーコンを使用しています。

ITPは、圧力駆動流とEOFによって引き起こされる分散に対して比較的ロバストである一方で、過度のEOFは、平均EOFの速度がITPの速度に等しくなるITPインタフェースの停滞につながる可能性があります^。14このような強力なEOFは、特に高pHの条件で発生します。と低イオン強度。このような理由から、我々は、pH 8以下で、便利な場合100mMのオーダーのイオン強度を持つバッファを使用することをお勧めします。我々の経験では、PVPはホウケイ酸塩チップのEOFを抑制するための最も効果的なコーティング。しかし、そのふるいの特性から、PVPは、このようなゲノムDNAを中心としていくつかのアプリケーション用の適切でないかもしれません。実験では、PVPの添加が大幅に（それは集中していませんポイントに）ゲノムDNAの絶対モビリティを減らすことができます観察します。これらのケースでは、界面活性剤（例えば、トリトンX-100）と、組み合わせてSigmacoteとしてシラノールコーティングはまた、EOFを減らすのに有効であること¹⁰

	TEアニオン（pKaは-1）
バッファ対イオン（PKA +1）	MES（6.10）	MOPS（7.20）	HEPES（7.50）	トリシン（8.15）
エタノールアミン（9.50）	21.41	20.40	17.38	22.85
トリス（8.08）	21.00	19.23	15.84	17.56
ビス - トリス（6.40）	18.22	10.41	7.30	5.23
ピリジン（5.18）	1.01	3.72	2.42	1.48

表1。 LEが100 mM HCl及び200mMの緩衝対イオンで ​​あるアニオン性のITPで調整された純粋な検体ゾーンの実効移動度の大きさ（×10 ^-9 M ² / V / s）である。

	TEの陽イオン（PKA +1）
バッファ対イオン（PKA -1）	エタノールアミン（9.50）	トリス（8.08）	ビス-トリス（6.40）	ピリジン（5.18）
MES（6.10）	35.57	21.96	16.39	10.45
MOPS（7.20）	35.47	20.92	9.76	3.93
HEPES（7.50）	35.35	19.97	7.77	2.88
トリシン（8.15）	34.77	16.72	4.50	1.44

表2。カチオン性ITPで調整された純粋な検体ゾーンの実効移動度の大きさ（×10 ^-9 M ² / V / s）のLEは、100mM塩化ナトリウム、200 mMのバッファリングの対イオンで ​​ある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
名	会社	カタログ番号	コメント
蒸留水	GIBCO	10977	アーゼ/ DNaseフリー
クロロックス超	クロロックス	02489CT
水酸化ナトリウム（NaOH）	マリンクロット	7708
塩酸（HCl）	EMDケミカルズ	HX0603-4
Trizma塩基（トリス）	Sigma-Aldrich社	T6066
ポリビニルピロリドン（PVP）	ポリサイエン株式会社	06067	MW100万
HEPES	Sigma-Aldrich社	H-4034
のAlexa Fluor 488カルボン酸	インビトロジェン	A20000
トリシン	Sigma-Aldrich社	T-9784
ビス - トリス	Sigma-Aldrich社	B4429
EDTA	GIBCO	AM9260G
トリトンX-100	Sigma-Aldrich社	X100
リゾチーム	Sigma-Aldrich社	L6876
SYBRグリーンII	インビトロジェン	S7564
エタノールアミン	Sigma-Aldrich社	411000
ローダミン6G	アクロスオーガニック（ヘール、ベルギー）	CAS 989-38-8
L-アミノ酸	Sigma-Aldrich社	LAA21
電源のSYBR Green RNA-に-C T 1ステップキット	アプライドバイオシステムズ	4389986
PCRプライマー	統合されたDNAの技術
装置
名	会社	カタログ番号	コメント
ホウケイ酸塩マイクロ流体チップ	キャリパーライフサイエンス社	NS12A	プラスチックキャディーの有無にかかわらず未
真空ポンプ	ガスト	DOA-P104-AA
ソースメータ	ケースレー	2410	定電流および定電圧動作モード
倒立落射蛍光顕微鏡	オリンポス	IX70	照明用水銀ランプ（オリンパス）やLED（Thorlabs）を使用して、
フィルターキューブ	オメガ	XF115-2	励起/発光：ブルー/グリーン
安全なロックマイクロ遠心チューブ	エッペンドルフ	022363204	1.5 mLの容量
遠心分離	エッペンドルフ	5417C

表3。特異的試薬および装置。