の性的開発と子嚢胞子放電フザリウムgraminearum種</em

サマリー

性的な交配と組換え後代の単離は、糸状菌のための重要な研究ツールです。フザリウムgraminearum種これらのプロセスを正常に行うに必要な技術が提示されています。

要約

フザリウムgraminearum種は糸状菌の開発と病原性の研究のためのモデル系となっています。F. graminearum種が最も簡単にんじん寒天培地上で、子のう殻と呼ばれる子実体を生成します。子のう殻は、被子器開発の特定の段階で生産、多数の組織型が含まれています。これらは、（外観の注文における）被子器のイニシャル（ascogenous菌糸を生じさせている）、外壁、副生体（ASCIを開発するまで、被子器の中心を占める滅菌菌糸体）、ASCI、及び子のう胞子の形成を含む子嚢¹⁴内。これらの組織のそれぞれの開発は約24時間で区切られ、性的発達^12,8の間にトランスクリプトーム研究の基盤となっています。各ステージの写真を含む開発のより詳細な説明については、ハレンら （2007）を参照してください。ここでは、同期の生成と収穫のための方法を提示LYは、遺伝子調節、開発、および生理的過程の時間的な研究のために子のう殻の芝生を開発しています。これらの方法は、Fで使用されるように具体的に書かれていますが、 graminearum種は 、技術が他の真菌のさまざまな目的で使用することができ、結実が培養で誘導することができます提供し、開発にはいくつかの同期があります。我々は最近、Fの性的発達を研究するために、このプロトコルを適応しているverticillioides。子のう殻を開発するの芝生が誘導されなかったため、個々の子のう殻は、この種に手を選ばれる必要がありますが、プロセスが開発（Sikhakolliとトレイル、未発表）を研究するためによく働いた。

菌類の子実体の中で最も重要な機能は、胞子の飛散です。子嚢菌（子嚢は菌類を生成する）の種の多くでは、胞子を介して（とepiplasmic流体）の胞子の放出を駆動し、子嚢内の膨圧の発生により、子嚢から撮影されてい子嚢の先端^2,7の細孔。強制子嚢胞子放電の我々の研究は、我々がプロセス内での変異をスクリーニングするために使用する "胞子放出アッセイ"の開発につながった。ここでは、このアッセイの詳細を提示します。

F. graminearum種はホモタリックであり、従って、互換性のあるパートナーの存在下で子実体を形成することができる。 homothallismの利点は、交差点では、この種の^14.7の性的発達の研究を促進してきた面の特定の形質の子孫のホモ接合体を生成する必要がないことです。しかし、異体性の株が^5,9を越えるため^に使用することができる生成されています。それは1つの菌株¹のいくつかの遺伝子の変異体を取得するにはホモタリック株を横断することも可能です。これは2株で1シャーレcoinoculatingによって行われます。ミーティング·ポイントに沿って、子のう殻の大部分は、（親系統のいずれかに変異を提供阻害しない組換えになります交配）。子のう殻の年齢として、彼らは強制的にそれらを排出するのではなく、子のう胞子大挙をしみ出させる。結果胞子滲出液は、（子嚢胞子塊と呼ばれる）被子器の先端に位置し、容易に個々の胞子の回復のために削除することができます。ここでは、組換え子のう殻および組換え子孫の回復の識別を容易にするためのプロトコルを提示します。

プロトコル

1。子のう殻を作り出す

1. Fの肥沃なひずみで6.0 cmの直径のペトリ皿の中心接種ニンジン寒天¹⁰ graminearum種 （PH-1を推奨）。
2. 場所は、室温（18-24℃）で明るい蛍光灯の下で料理を接種し、菌糸体は、ペトリ皿（3-5日）の外側の端に達するまで成長することができます。市販の家庭用蛍光灯では、子実体の形成と放出を刺激するために正常に動作します。
3. 穏やかに滅菌爪楊枝で菌糸を削除します。
4. 滅菌ガラス又は滅菌hockeystickガラスロッドの丸みを帯びた端と表面に1.0ミリリットル2.5パーセントのTween 60水溶液を配布しています。
5. 光板を返します。プレートにパラフィルムを追加しないでください。
6. 24時間後、プレートの表面は光沢のある外観を持つ必要があります。もし菌糸が再び表示され、スクレープ表面および再適用のTween-60ソリューションを提供します。
7. 来週上の子の​​う殻の発達を観察します。の中間段階被子器の開発が静かにRNA抽出（ 図1）凍結寒天とフラッシュの表面をこすることによって収穫することができます。
8. 成熟した胞子は7日からプレートの蓋に蓄積されます。当初はこれらの唯一の実体顕微鏡の下に表示されますが、9日目で、彼らは肉眼で見えるとなるように十分な密度に蓄積されているでしょう。

2。子嚢胞子の放出アッセイ

1. ツイーン溶液の塗布後6日目に、木のボーラーで寒天の1 cmの直径の円を切り取る。また、メスは、同様のサイズのセグメントを削除するために使用することができます。円を半分にスライスして各半分はガラス顕微鏡スライド上に配置することができます。
2. オリエントは断片ので、子実体を含んでいる面がスライドの表面に垂直であり、胞子は、スライドの長さをダウンして起動されます。
3. 照明の下で一晩湿度チャンバ内でスライドを配置します。胞子に蓄積されスライドと肉眼で見えるように翌朝（ 図2）。
4. 必要に応じて蓄積された胞子は水でスライドをオフに洗浄し、定量化することができる。
5. 潜在的な子嚢胞子の放電阻害剤は、アッセイの組み立て時の寒天ブロックの背面側にそれらを追加することによって測定することができる。排出を削減するいくつかのイオンチャネル阻害剤は、以前にこのテクニックを¹⁵に検定されています。

3。組換え子孫の世代

1. F.の2系統とニンジン寒天培地を接種することによりクロスを開始graminearum種 （1寄生虫の卵+一NIT-）、ペトリ皿の両側に接種ポイントを配置する。
2. 一度菌糸が空中部分をこすり、表面を充填し、上記のようにトゥイーン-60ソリューションを適用しています。菌糸が満たすペトリ皿の側面に注意することはマーカーを使用しています。
3. 光に文化を返し、子のう殻が開発されるまでインキュベートし、cirrhiがありました二つの文化の交点に沿って子のう殻から形成する銃。
4. 解剖顕微鏡下では、ビューに二つの文化の交差点に沿って子のう殻をもたらす。虫ピンを使用して、滅菌し、滅菌水に浸し、ピンの先端で軽くこの縁に沿って子嚢胞子塊をタッチします。ピンの水分子嚢胞子塊がピンに固執することができるはずです。
5. 胞子を洗い流すためのエッペンドルフチュー​​ブに200μlの滅菌水でその上に子嚢胞子塊のピンの先端をすすぎます。
6. 炎ピンは、再びそれを湿らせて、別の子嚢胞子塊を選択します。 10から15 cirrhiを選んで、水の別のチューブにそれぞれを配置します。
7. サスペンドcirrhiを含む簡単にボルテックスチューブ。
8. 9センチメートルペトリ皿の中MMTS媒体¹上にピペットと場所で胞子懸濁液の60μlを削除します。滅菌したホッケーのスティックと広がった。残りの胞子懸濁液は最大1週間までは4℃で保存し、必要に応じてプレーティングすることができます。
9. インキュベーション3〜5日間室温でTE（光は必要ありません）非常に小さなコロニーが（ 図3）が表示されるまで。コロニー間の表現型の二種類が存在します。 NIT-コロニーは、NIT +のコロニーよりスパースな菌糸を持ちます。組換え子のう殻からCirrhiはほぼ等しい割合でコロニー表現型の両方が表示されます。その上、単一の表現型のコロニーでプレートを破棄します。時にはつ以上の表現型が他の要因の分離のために生じることに注意してください。
10. V8またはストレージ用のニンジン寒天培地にコロニーを移動します。正しい表現型を確認するために、ドックスのドックス寒天培地（NIT-株はツァペックのドックスに成長しません）上および塩素（NIT +株は塩素とPDAになることはありません0.5 M塩素酸カリウム）とPDA上のテストコロニー。希望する品質のためにこれらのコロニーを調べます。

4。代表的な結果

子のう殻を作り出す

目標は、芝生を持つことであるすべての菌糸または胞子明らかせずに子のう殻。文化の表面は黒いベルベット（ 図1）に似て表示されます。 Tweenの塗布後24時間で寒天の表面には若干の光沢を持つ必要があります。菌糸再度表示されている場合、プレートは被子器の開発を誘導するために十分なスクレイプされていない可能性があります。

子嚢胞子の放電

常にあなたのアッセイで、野生型株から寒天のいくつかのブロックを提供します。それらが起動しない場合は、どちらかあなたの子のう殻は若すぎるか古すぎる。彼らは古すぎる場合には、多数の菌糸はそれを白っぽい色合いを与える文化の表面上に表示されます。これはそうでない場合、彼らは若すぎるかもしれませんし、このアッセイは、24時間で再び試行すべきである。時折、文化も放電しないし、実験が繰り返されなければなりません。あなたは適切な光条件下でアッセイを行うことを確認してください。

組換え後代

組換え子のう殻は、2つの系統間の交差点に沿って子のう殻の大部分を確認する必要があります。我々は通常のクロスから10 cirrhiを処理し、それらの少なくとも4-6組換えなければなりません。ごくまれに、突然変異が交配から歪みを防ぐことができます。両親のいずれかが異常増殖表現型を持つ場合、2つ以上の表現型はMMTS上のコロニーの間で存在する可能性があります。

図1ニンジン寒天培地上に被子器開発の段階。トゥイーンを適用した後、左、72時間。赤色顔料、表面に黒い粒のように見える非常に若い子のう殻に注意してください。右、144時間後、成熟した子のう殻で形成されています。両方の文化では表面的な菌糸体のほぼ完全な欠如に注意してください。

図2放電アッセイ。オレンジ色のニンジン寒天プラグイン指向のようにthaのです​​。強制的にその表面に成熟した子のう殻から排出されるトン胞子はスライドグラスの表面に蓄積することができます。 15時間の累積時間。

図3選択MMTS媒体上に寄生虫の卵+およびNIT-コロニーの間に成長の違い。 NIT-コロニーは（矢頭）小さくなります。寄生虫の卵+コロニー（矢印）が力強い成長を示しています。写真は7日後に撮影。

ディスカッション

F. graminearum種は、特によく注釈付きゲノム（の在庫状況により子実体の開発研究に適応しているmips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ^4）、および可用性アフィメトリクス·マイクロアレイ⁶に基づいて。これは、子嚢胞子の放電^7,11,3のために重要な遺伝子を識別する能力を促進しています。ここで紹介する方法は、研究者は、Fの子実体の遺伝的解析のための発達段階と関数の離散集合に集中することができます。 graminearum種 。方法はまた、文化のフルーツに誘導することができ、他の真菌子実体の種類の様々な開発のための標準として使用することができますに関連する菌類に容易に適応可能である。

胞子焼成表現型を評価する能力は、胞子が見て小さいと困難な種などで微妙なことができます F. graminearum種。洗浄したスライド上に胞子のコレクションは、胞子がスライドをオフに洗浄し、定量することがありますので、視覚的評価、定量評価の両方を容易にします。いくつかの菌種は、その胞子を取り囲み、胞子は洗い流すことはできませんが、彼らはスライド上に残って顕微鏡でカウントする必要があり粘液を生成します。我々は、 菌核sclerotiorumの真であることを発見した。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
フザリウムgraminearum種株PH-1	真菌の遺伝ストックセンター、カンザス州	FGSC 9075
ツイーン60	Sigma-Aldrich社	P1629
ドックスのドックス寒天培地	Difco社、ベクトン·ディッキンソン	233810
塩素酸カリウム	Sigma-Aldrich社	255572