凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

サマリー

ここでは、液体窒素を充填したデュワータンクからサンプル取得のための低コスト、耐久性のあるcryotolerantデバイスを提示します。装置の構成とモジュール設計のしやすさ、安全かつ容易に極低温タンクからのサンプル取得のプロセスになります。

要約

液体窒素の圧力下に置かれ、無色、無臭、非常に冷たい（-196℃）で液体である。それは一般的に、血液、細胞や組織の^1,2のような生物学的物質の長期保存のための極低温流体として使用されます。液体窒素の低温の性質は、サンプルの保存のための理想的な一方、接触のライブの組織の急速凍結を引き起こす可能性があります- '凍傷' ²として知られている、密接にストレージ、デュアーからのサンプルの取得に関係者に重度の凍傷につながる可能性があります。さらに、液体窒素が蒸発としては、特に限られたスペース²に、空気中の酸素濃度を低減し、窒息を引き起こす可能性があります。

研究室で、生物学的サンプルは、多くの場合、デュワータンク¹内のステンレス製ラックに積み重ねcryovialsまたはcryoboxesに格納されています。これらのストレージラックは、ラックからも抜けボックスを防止するために、長いシャフトととの底面に用意されていますルーチン処理時のデュアー。すべて余りに頻繁に、しかし、貴重なサンプルのボックスまたはバイアルに抜け出し、液体窒素を充填タンクの底に沈む。そのような場合には、サンプルがうんざりするほどのスペア容器または廃棄するに液体窒素を転送した後に取得することができます。箱やバイアルは、比較的安全に空にデュワーから回収することができる。しかし、液体窒素とその膨張率の低温性質が沈没したサンプルの取得危険になります。それは一般的にサンプルの検索が一人で行っ決してすることが安全局によって推奨されています。別の方法としては、バイアル^3を取り出して、市販のクールグラバーやトングを使用することです。しかし、暗い液体充填デュアー内の限られた可視性は、それらの使用に大きな制限が課される。

本稿では、安全な両方の極低温流体を含むデュワーからのサンプルの取得を行うCryotolerant DIYの取得、デバイスの構造を記述する簡単に購入する。

プロトコル

1。 Cryoboxesの検索のためのCryotolerantデバイスの組立

1. ペンチを使用して、 図1Bに示すように、強力なネクタイLは形にする（ 図1A）3面の強いタイの一面をまっすぐ注：強力なネクタイの寸法は、デュワーの首の直径に応じて選択することができます。
2. 図3（AB）に示すようにCryoscoop基盤を形成するために、クラウンのボルトナット、ワッシャーとネジを使用して強力なネクタイTストラップ（ 図2）このような2つの強い結びつきを確保する注：2つの強い絆の検索を可能にするために使用されている5½インチ×5½インチcryoboxes。
3. 溝付きプレート（ 図4）を使用して 、スロット板の一方の端のスロットに強力なネクタイTストラップのスロットを合わせ、ヒルマンナットとボルト（ 図5）の助けを借りて2つを確保する注：場合スロット板と強力な提携のは共存しません私は、事前にドリル穴を使用すれば、超硬ドリルビットを使用して、ドリル穴を持っている必要があります。
4. 図6に示すように、ペンチの助けを借りて、スロット板のもう一方の端を曲げます。 （この手順は省略可能です）。
5. 液体窒素中で図6に示すように、ときに優れたデバイスを把握するために泡でハンドルをラップします。 （オプション） 注意：オートクレーブの前に泡を削除します。

2。 Cryovialsの検索のためのCryotolerantデバイスの組立

Cryotolerant DIYの検索装置は、cryovialsの取得するために適合させることができます。これは液体窒素（ 図7）からバイアルをすくうための改変に示すようにステンレス製のストレーナーとフラットベースを置換が含まれます。

1. 溝付きプレートに強力なネクタイTストラップを取り付けるネジを外し、クラウンナットとボルト。
2. 溝付きプレートにステンレス製のストレーナーを取り付ける前に、そっとの首を曲げる。鍋（ 図8）に似せて角度で向きをベースにペンチの助けを借りて、ストレーナー注：ストレーナーはリップが付属している場合は、唇を曲げてペンチを使用して、これは容易にデバイスで操縦しています。
3. 溝付きプレートの穴に沿ってストレーナーのハンドルの穴を合わせ、 図8に示すように、ヒルマンナットとボルトの助けを借りて、ストレーナを固定注：ストレーナーはプレドリル穴に付属していない場合は、次のものが必要となります超硬ドリルビットであけられた穴を持つように手配します。

3。デュワーから取得CryoboxesとCryovials

1. 開始するには、極低温の手袋をつけて、操縦のスペースを確保するためにデュワーから1または2フリーザーラックを削除します。
2. 優しく強いネクタイTストラップ·ベース（ 図5）を装備直立Cryotolerant DIY取得デバイスとデュワーの底に沿ってこすり、ボックスfalleを収集するデュワータンクの底にn 注：液体窒素の沸騰は、すぐに暖かい物体と接触すると、窒素ガス（ライデンフロスト効果）を絶縁内のオブジェクトを包む。サンプルの取得する前にデバイスを冷却するために、ゆっくりとデュワーにデバイスを浸すと、液体窒素は、上記の手順に進む前に十分にデバイスを冷却することができます。
3. タンクのうちフリーザーボックスをすくうためにデュワーの壁に沿って直立デバイスを引き出します。
4. デュワーの底から取得したボックスをつかむ。
5. cryovialsを取得するために、穏やかにストレーナー（ 図9）を装備しcryoscoopとデュワーの底をこすり。
6. cryobox検索と同様に、直立デバイスを引き出し、ストレーナーで収集されたバイアルをつかむ。

4。代表的な結果

遺伝子発現研究における主要な課題は、RNAの品質は保管条件に依存していることです。両方の凍結組織サンプルのRNAと^4を抽出した。 図10は、トータルRNAの完全性のサンプル処理の効果を示しています。同じ組織源（ヒト脂肪）からのトータルRNAは、異なるサンプル処理に供した。実験前に、無傷のトータルRNA preparateは約2倍の18S rRNAのバンド（ 図10、レーン1）のような激しいとして28S rRNAのバンドとの明確な28Sと18S rRNAのバンドを示しています。 18Sの強度比が2:1 ⁵から出発する：この2:1の比率（28S：18S）は、部分的に分解したRNAは、塗抹標本、またはその28Sのように表示されますが、RNAは無傷であることを示しています。 3から4レーンは大幅に低下してRNAサンプルを示しています。これらのRNAサンプルは、このように定期的に堕落したバイアルの取得の必要性のためにデカントし、ボックス（ 図10、3-4レーンと長期的なストレージをモデル化し、デュワー（方法）から、短期取得の繰り返される部分defreezingに供した。）しかし、サンプルはデュワーサービスに格納されているDIYのデバイス（方法B）と、このように、部分的なdefreezingを使用して、インタクトなRNA（ 図10、レーン2）を含んでいます。

図1。 A）基地は、2つの3面の強力なネクタイに示した寸法で構成されています。それぞれ強力なネクタイは、一つの大きなプレドリル穴（実線の矢印）と、各面に複数の小さな穴（小さい矢印）が含まれています。これは、ナットとボルトで固定できるようにするオプションを提供しています。また、小さな穴は、サンプル取得時に液体窒素の迅速な排水を可能にします。B）の強いタイのそれぞれの片側がL字型の強力なネクタイにするペンチの助けを借りてまっすぐにされています。

図2：厳密なネクタイTストラップが一緒の強い結びつきを確保するために使用されます。強力なネクタイ、T-ストラップのように一つの大きなプレドリル穴（実線の矢印）と二つの小さな穴（Smalのを持っている各コーナーにL矢印）。ナットとボルトを使用して、ペニスバンド - これは、Tの長さに沿っての強い結びつきを確保することができます。また、溝板にT-ストラップを固定することができます。

図3。 a）各強いネクタイ）は、B。冠ボルト、ナット、ボルト、ワッシャを使用して、その長さに沿って、T-ストラップの一方の隅に固定されている二つの強い絆は、5½インチ×5½を取得するために、お互いに隣接して固定されているcryoboxesインチ。このようなインチX 2インチ2のような小さいcryoboxesは、単一の強力なネクタイは、T-ストラップなしでスロット板に直接固定することができます。

図4は、平板は、ハンドルとして使用されているスロット。溝付きプレートの長さはデュワーの深さに依存します。このケースでは、スロット板の4フィートが使用されています。スロット板の厚さが重要なのです。デュワーを満たした液体窒素からサンプルを取得中に細い溝プレート（<14ゲージ）は、デバイスが薄っぺらするインス。

図5。の強い絆とTストラップで構成されるフラットベースは、その後スロット板の一端に固定されています。 Tストラップの残りの角に大きな穴が平板上のスロットに合わせ、六角ボルトとナットを使用して固定されている。このデバイスは、現在デュワーからcryoboxesを取得するために使用することができます。

図6。スロット平板の一端は、ペンチを使って曲げて、この場合に示すように、特に深いデュアーのためのより良いグリップを提供するために泡で覆われています。

図7：ワイヤーメッシュ、ステンレス鋼製ハンドル付きストレーナーデュワーからcryovialsを取得するために使用されています。ハンドルはスロットで提供されていない場合、超硬ビットドリルは穴をあけるため必要となります。

図8。cryovialsの検索を容易にするためには、ストレーナーは、鍋の形ストレーナを得るためにペンチを使用して、首に沿って折り曲げられている。ストレーナーは、この場合のようにリップが付属している場合は、ペンチは、それを曲げるために使用できます。これは、ストレーナはデュワー内に巻き込まれないことが保証されます。

図9。ストレーナーは、六角ナットとボルトを使用して1つの端に溝付き平板に固定されている。

図10。のトータルRNAサンプルの完全性は、異なるサンプル処理条件に供した。RNAの品質はcを処理するサンプルでどのように影響されるか調べるためにonditionsは、同じソースからのRNAサンプルのセットは、ハンドリングの2つの方法に供した。メソッドのため、DIYのデバイスを使用して、サンプル取得時にかけデュワー、部分的なdefreezingでRNAのストレージで構成されていた。方法Bは、このように、定期的に落ちたサンプルを取得するためにデカントで長期保管をモデリングし、デュワーからの短期取得の繰り返される部分defreezingにさらさデュワー中のRNAのストレージで構成されていた。トータルRNAの整合性は、その後、ゲル電気泳動によって分析した。 Lane1：デュワー内の記憶の前にサンプル、レーン2：デュワーからのサンプルは、メソッドによって取得を受け、レーン3、4：方法Bによって検索の対象とデュワーからのサンプル、M：100 bpのラダー。

ディスカッション

デュワータンクの底からcryoboxesとcryovialsを取得する最も一般的な方法の1つは、予備容器に液体窒素をデカントし、デカントし、液体窒素中でフラスコまたはフローティングに残っているサンプルを引き出すことです。しかし、これは、液体窒素蒸気に長時間さらされる²による低温火傷や窒息を引き起こす可能性があり危険な習慣です。落ちcryovialsの取得他の一般的な方法は、クライオバイアルトング³の使用を含む。しかし、液体窒素で満たされたタンクの暗い空間内の限られた可視性は、その機動性を制限します。

上記のCryotolerant DIYの検索装置は、限られた可視性との深いフラスコの底から落ちcryoboxesとcryovialsを取得するための安価で、安全で簡単な代替手段を提供します。 DIYの検索装置の処理のしやすさ、検索の前にフラスコを空にする必要性を回避します。また、RETの助けを借りて、クライオバイアルのrievalは、デバイスが単一の個人によって行われることができると言いました。さらに、DIYの検索装置の使用は実質的に同じユニ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒルマン·グループメッキスロットフラット1-3/8 X 4フィート、14ゲージ	ローカルハードウェアのショップ	N / A	1ユニットが必要
クラウンボルトステンレス＃6 - オーバルヘッドフィリップスドライブの機械ネジ32インチ×3/8	ローカルハードウェアのショップ	モデル＃42281	必要な4単位
クラウンボルト亜鉛メッキスチールフェンダーワッシャーインチ×1-1/2インチ3月8日	ローカルハードウェアのショップ	モデル＃20122	必要な4単位
クラウンボルト亜鉛めっき＃8-32ネジのナット	ローカルハードウェアのショップ	モデル＃18512	必要な4単位
シンプソンストロング - タイBC40Zハーフベース4インチIn.x4	ローカルハードウェアショップ	モデル＃BC40Z	必要な2台
Tストラップインチ×6インチシンプソンストロング - タイ6	ローカルハードウェアのショップ	モデル＃66T	1ユニットが必要
オナイダ6 "メッシュストレーナー	地元の食料品店	モデル＃7859W	1ユニットが必要
ヒルマン·グループでは、六角ナット3/8-16の亜鉛メッキ	ローカルハードウェアのショップ	モデル番号：810509	必要な6単位
ヒルマン·グループでは、六角ボルト3/8- 16亜鉛メッキ	ローカルハードウェアのショップ		必要な4単位
絶縁用泡	ローカルハードウェアのショップ		1ユニットが必要
ねじ回し	ローカルハードウェアのショップ		1ユニットが必要
ペンチ	ローカルハードウェアのショップ		1ユニットが必要