軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

サマリー

我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示しアメフラシ。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。

要約

これは、細胞内カルシウムの変化はシナプス可塑性の重要な形態（例えば、homosynaptic促進^）1の数の誘導を仲介することが示唆されている。これらの仮説は、同時に細胞内カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を監視することによってテストすることができます。我々は、これは細胞内記録技術とカルシウムイメージングを組み合わせることによって達成することができる方法を示しています。我々の実験は、軟体動物アメフラシcalifornicaの頬神経節で行われている。この準備は、実験的に有利な多くの特長を備えています：Gangliaのは容易アメフラシから削除され、実験は通常のシナプス結合を作ると、通常のイオンチャネルの分布を持っている成人のニューロンを使用することができます。 アメフラシのために自然である動物の低代謝率と比較的低い温度（14-16℃）のために、準備が長時間安定しています。 ENT ">我々は簡単にイオントフォレーシスを介したニューロンに"読み込まれる"カルシウムオレンジ²の細胞透過性のバージョンを使用します。この長波長蛍光色素はカルシウムに結合すると、蛍光強度が増加し細胞内遊離カルシウムの変化を検出するためにはカルシウムオレンジありレシオメトリック色素（例えば、フラ2）とは異なり、高速の速度論的性質³とは、イメージングのためのフィルターホイールを必要としません。それは安定したかなりの写真や他の色素（例えば、フルオ^3）2,4未満光毒性です。すべての非レシオメトリックと同様に染料、カルシウムオレンジはカルシウム濃度の相対的変化を示していますしかし、それはロードと拡散による色素濃度の変化を考慮することはできないので、それは絶対的なカルシウム濃度を提供するためにキャリブレーションすることはできません。

直立、固定ステージ、複式顕微鏡は、毎秒30フレームの周りの記録が可能なCCDカメラで画像ニューロンに使用されていました。 アメフラシこの時間分解能で細胞内カルシウム濃度であっても単一のスパイク誘発性の変化を検出するために十分です。シャープ電極を同時に同定前とシナプス後ニューロンにシナプス伝達を誘導し、記録するために使用されます。各試験の結論では、カスタムスクリプトは、電気生理学やイメージングのデータを結合します。適切な同期を確実にするために、我々は顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDからの光パルスを使用しています。シナプス前カルシウムレベル（細胞内EGTA注射を介してなど）の操作は、私たちは様々な形態の可塑性を媒介する細胞内カルシウムの役割に関する具体的な仮説をテストすることができます。

プロトコル

1。準備

1. 75〜100ミリリットル等張塩化マグネシウム溶液を注入することにより、動物を麻酔。我々はイメージングのために使用アメフラシは、一般的に 150〜200グラムあり、Marinus Scientificから得られる。
2. ワックス覆われた皿に麻酔動物をピン。注射針は、この目的のためによく働く。無菌テクニックは必要ありません。総鉗子および標準はさみを使用すると、動物の足の切開を行い、口腔内の質量を公開します。頬神経の位置を確認します。すべて頬神経を切断することによって春のはさみと微鉗子、慎重にフリー神経節を使用しています。
3. 神経節を取り出して、人工海水を含むシルガードコートディッシュに入れてください。神経を安定させるために頬の神経が通っていくつかの昆虫ピンを配置。 Desheath細胞内記録のためのニューロンを公開するために極細鉗子と春のはさみ、ようを使って頬の神経節。その後、約15細かい虫（minを使用して再ピンガングリオンutien）ピン。どんな動きが撮像中に問題となるような神経は、所定の位置にしっかりと保持されなければならない。

2。電極を準備

1. フィラメント（例えばWPI TW100F-4）とプラー付きガラスキャピラリーチューブを用いて電極を引き出します。設定は、個々に必要な抵抗の電極を作成するために決定されるべきである。電極は面取り工程を省略した場合面取り、または約5 Mオームされる場合は、3MのKAc（酢酸カリウム）で満たされたときに私たちの電極抵抗が10 Mオーム程度である。
2. シリンジとmicrofil針を使用して3 M KAc/30 mMのKClを含む溶液と電極の1組を記入してください。これらの電極は、電気生理学的に使用されます。
3. 染料の電極のバックエンドを浸漬することによりカルシウムインジケーター色素を有する電極の2番目のセットを埋める、以前に約で再構成。 500μg染料の40μlの蒸留水。電極の先端が満たされたとき、背中約1/4インチを埋める良好な電気的接触を確保するためのKCl 200mMのと電極の端の。
4. これは色素注入を容易にし、複数の膜貫通による被害を減少させるので、それは、ベベル電極に有益である。我々は、塩水/アルミナ粉末懸濁液の流れを生成するカスタムbevelerを使用しています。電極をホルダに取り付けられ、その先端は45°の角度で流れに入ります。電極抵抗は連続的に監視し、面取りは抵抗のKAc充填電極の約5 Mohmをに達したときに終了します。染料埋め電極は同じ時間のために面取りされ、通常15から20 Mohmをの抵抗を持っています。

3。カルシウム指示薬色素のロード

1. 電気生理学リグの準備を配置し、視覚的に興味のあるシナプス前ニューロンを見つけます。我々の実験の多くは、給餌、B21 ^5,6の間に利用同定感覚ニューロンで行われます。比較的固定positionは、大きさ（〜100μm）を、そしてB21のソーマの細長い形状は見つけることが容易になります。
2. カルシウムインジケーター色素を含有する電極との利害のニューロンを突き刺す。 B21のIDはシナプス後ニューロンB8をimpalingによって確認することができます。 〜8 nAの電流でB21の脱分極は、スパイクとB8 ⁷へのPSPのインストールを容易にする結果を引き起こします。
3. 約30分間過分極パルス（通常は-15 NA、1 Hzの、75％のデューティ·サイクル）を渡すことによって、興味のシナプス前ニューロンに色素を注入します。色素ローディングが成功した場合は、ニューロンの細胞体は、かすかなピンクの色を取得します。ゆっくりニューロンからそれを引き出すことによって色素含有電極を外します。
4. 染料はフォロワニューロンとシナプスを作る微細なプロセス中に拡散するまで、約30分のための準備を残す。

4。カルシウムイメージングと電気生理学的記録

1. イメージングmicroscに準備を置きOPE。準備と皿はぬれた粘土とは違って、粘り気のまま、Permagumシールコードの断片で冷却プラットフォーム上に保持されている。固定ステージ顕微鏡は、対物レンズを移動させることで焦点を当てています。ステージでは、磁石マウントマニピュレータを装着可能にする、静止したままである。高倍率は振動（特に横移動）が問題になり、全体のイメージングの設定が防振プラットフォーム上に配置する必要があります。
2. 通常の電解質溶液を含む電極を持つシナプス前とシナプス後ニューロンを突き刺す。
3. 画像カルシウムオレンジ（励起549 nmの発光576 nm）を⁸に適したフィルタブロックを選択して、カメラを調整します。最も科学的なCCDカメラは、調査員が読み出されるCCDセルのサブセットを選択することができます。さらに、細胞（ビニング）組み合わせることができます。ビニング増加感度ながら小さなサブセットを選択すると、速度が向上します。これらの2つの設定は、一緒に露光時間で、決定フレームレートは、1秒間に取得することができますどのように多くの画像、すなわち。適切な設定は、画像580×500×300ピクセル（10倍レンズと0.5倍のカメラアダプタを使用）と350μmの²の面積を務める。露光時間<25 msの適正露出を提供する最小限の量に照度を調整する光路に中性濃度フィルタを追加します。 アメフラシに十分な速さで画像単一スパイク誘発カルシウム変化することである-これらの設定は、約30Hzのフレームレートをもたらすべきである。最後に、唯一の撮影領域が点灯しているように、視野絞りを閉じます。
4. イメージングソフトウェアで、測定したいニューロンの領域をマークします。要素のARソフトでは、これは、興味のある領域（ROI）を置くことによって "時間測定"セクションで行われます。 B21は双極性ニューロンと前作でその横方向のプロセスに接触関心⁹のシナプス後ニューロンが実証されています。一般的に我々のイメージは、プライマリ、セカンダリ、および三次のブラジャーニューロンの各部分の上にROIを配置することにより、横方向のプロセスのnches。染料埋めニューロンの隣にある追加のROIは、後で他のすべてのデータポイントから差し引かれるバックグラウンド値を提供するために測定されます。
5. カメラの "フレーム読み出し"信号によって提供されるトリガ信号を待つために電気生理学的買収を（これらの実験スパイクIIに）指示しています。画像取得（要素、AR）を起動して、カメラが最初のフレームを取るときにスパイクIIは自動的に録音を開始します。また、簡単に顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDをオンにするには1401電源のTTL出力を使用することができます。これはその後イメージングと電気生理学的なデータを同期させるための信号を提供します。
6. 所望の周波数で短い脱分極電流パルスのシリーズを注入することにより、シナプス前ニューロンを刺激する。活動電位はsuccessfあるかどうかを決定するために、各パルス（オシロスコープをトリガ刺激などによる）監視することが重要ですully生成。カルシウムオレンジは他の染料に比べて非常に安定した写真ですが、それは漂白染料がどのように発生するかを確認するためにはるかに刺激せずに、コントロールトライアルを記録することをお勧めします。
7. 細胞内カルシウム濃度が操作された実験では、このようなEGTAのような薬物は、シナプス前ニューロンに導入され、前述の刺激やデータ収集の手順が繰り返されます。

5。代表的なデータの分析

1. テキストフ​​ァイルに書き込むことによって、画像データ（各ROIの測定された強度値のリスト）をエクスポートします。スパイクIIでカスタムスクリプトは、テキストフ​​ァイルをインポートすることができます。このスクリプトは、個々のプローブの領域を使用して値を正規化し、バックグラウンドプローブの値を減算します。データポイントは、その後 "仮想RealWave"チャンネルとして電気生理学的データと一緒にプロットされます。スパイクIIにおける "チャネルプロセス/タイムシフト機能"は正確に撮像データポイを整列するために使用される参考として、LED信号を使用してNTS、。
2. パーセントの変化に応じて値を取得するには、DF / F _O = _FF（O）/ F _Oとしての蛍光の相対的な変化を計算することにより、画像データを分析します。 F _Oは単なる刺激時の刺激とF蛍光の前に蛍光レベルを示します。

6。代表的な結果

図1実験の全体的なスキーム。実験は、 アメフラシの神経節の準備で行われます。細胞内カルシウムの変化は、イオン泳動シナプス前ニューロンに導入され、蛍光色素、で撮像する。そのシナプス伝達を誘導し、監視できるように、事前とシナプス後ニューロンはその後鋭い電極と突き刺されています。

図2カルシウムイメージングとアメフラシの頬神経節内の識別されたニューロンから細胞内記録。ニューロンB21の画像化された側枝の（）写真。ボックスには、関心の測定領域を示している。 B21の（B1）の細胞内刺激は、それはまた、活動電位を発生させる原因となって、シナプス後ニューロンフォロワーB8（真ん中のトレース）に活動電位（下のトレース）と容易性シナプス後電位（PSP）を彷彿とさせます。シナプス前カルシウム蛍光の増加は上のトレースに示されている。 homosynaptic円滑化に関するEGTAのシナプス前（B2）の効果。 EGTAは細胞内に注入したB21〜15分前に、細胞内刺激。それは、EGTAが低濃度でシナプス伝達を抑制するのに十分速くない遅効カルシウムキレート剤、であると考えられている。広範囲のカルシウム信号とPSP振幅の対応する減少の減少に注意してください。 （C）は、PSPの振幅は、シナプス前calciuと相関M信号。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

ディスカッション

我々は同時に、細胞内カルシウム濃度を監視し、シナプス伝達の有効性を評価するために用いることができるテクニックを紹介します。これらの技術は、短期可塑性の様々な形態が仲介されているどのように判断するのに役立ちます。

イメージングは​​蛍光顕微鏡とCCDカメラを用いて行われる。ほとんどの機能イメージングのセットアップと比較した場合、これらの機器の要件は比較的控えめです。手法はシンプルで簡単に習得することができます。 CCDカメラで撮像が良い時間分解能を持つ大面積の可視化を可能にしながら、空間分解能が制限されています。したがって、細胞内カルシウムの比較的広範囲または "背景"が増加の役割についての仮説をテストするための有用な技術である。棘における空間分解能および研究カルシウム動態を改善するために、レーザー走査型共焦点顕微鏡、または2光子顕微鏡とカルシウム指示薬カルシウムグリーンを私は可能性プロトコル¹⁰のわずかな変更で使用すること。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬名	会社	カタログ番号	コメント
カルシウムオレンジ	インビトロジェン	C-3013
EGTA	シグマ	E-4378
カルシウム校正バッファーキット	インビトロジェン	C-3008MP	信号の感度とダイナミックレンジをテストするのに便利
塩化マグネシウム六水和物	シグマ	M0250	動物を麻酔する0.33 M溶液で使用

設備名	会社	コメント
FN-1直立蛍光顕微鏡	ニコンインスツルメンツ	ナリシゲと、ITS-FN1ステージ
NMN-21マニピュレータ	ナリシゲ	磁石と一緒にステージに取り付けられた
CoolSNAP HQ 2 CCDカメラ	Photometrics
NISの要素、AR （バージョン3.22）	ニコンインスツルメンツ	イメージングソフトウェアは、蛍光データを取得するために使用
10X/0.3wプランフルーア客観	ニコンインスツルメンツ	この水浸レンズは3.5mmの非常に長い作動距離を持つ
X-Citeの120 PCのメタルハライドランプ	エキスフォ	蛍光イメージングのために使用
LS-DWL ハロゲンランプ	Sumica
ET-CY3フィルターセット	クロマ·テクノロジー	;
パワー1401 A / Dコンバータ	ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン	サンプリングは3 kHzで行われていた
スパイクII （バージョン7.07）	ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン	電気生理学的データを取得するために使用されるソフトウェア
SEC-10 LXアンプ	NPIエレクトロニクス	10Xヘッドステージで使用
モデル410アンプ	ブラウンリー精度	信号を増幅し、フィルタリングするために使用
WS-4	マイナスKテクノロジー	イメージングのための防振
冷却プラットフォーム	カスタムメード	真鍮板に経由氷水を可変速度で励起される