軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタアメフラシ

Summary

我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示しアメフラシ。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。

Abstract

これは、細胞内カルシウムの変化はシナプス可塑性の重要な形態（例えば、homosynaptic促進^）1の数の誘導を仲介することが示唆されている。これらの仮説は、同時に細胞内カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を監視することによってテストすることができます。我々は、これは細胞内記録技術とカルシウムイメージングを組み合わせることによって達成することができる方法を示しています。我々の実験は、軟体動物アメフラシcalifornicaの頬神経節で行われている。この準備は、実験的に有利な多くの特長を備えています：Gangliaのは容易アメフラシから削除され、実験は通常のシナプス結合を作ると、通常のイオンチャネルの分布を持っている成人のニューロンを使用することができます。 アメフラシのために自然である動物の低代謝率と比較的低い温度（14-16℃）のために、準備が長時間安定しています。 ENT ">我々は簡単にイオントフォレーシスを介したニューロンに"読み込まれる"カルシウムオレンジ²の細胞透過性のバージョンを使用します。この長波長蛍光色素はカルシウムに結合すると、蛍光強度が増加し細胞内遊離カルシウムの変化を検出するためにはカルシウムオレンジありレシオメトリック色素（例えば、フラ2）とは異なり、高速の速度論的性質³とは、イメージングのためのフィルターホイールを必要としません。それは安定したかなりの写真や他の色素（例えば、フルオ^3）2,4未満光毒性です。すべての非レシオメトリックと同様に染料、カルシウムオレンジはカルシウム濃度の相対的変化を示していますしかし、それはロードと拡散による色素濃度の変化を考慮することはできないので、それは絶対的なカルシウム濃度を提供するためにキャリブレーションすることはできません。

直立、固定ステージ、複式顕微鏡は、毎秒30フレームの周りの記録が可能なCCDカメラで画像ニューロンに使用されていました。 アメフラシこの時間分解能で細胞内カルシウム濃度であっても単一のスパイク誘発性の変化を検出するために十分です。シャープ電極を同時に同定前とシナプス後ニューロンにシナプス伝達を誘導し、記録するために使用されます。各試験の結論では、カスタムスクリプトは、電気生理学やイメージングのデータを結合します。適切な同期を確実にするために、我々は顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDからの光パルスを使用しています。シナプス前カルシウムレベル（細胞内EGTA注射を介してなど）の操作は、私たちは様々な形態の可塑性を媒介する細胞内カルシウムの役割に関する具体的な仮説をテストすることができます。

Protocol

1。準備

1. 75〜100ミリリットル等張塩化マグネシウム溶液を注入することにより、動物を麻酔。我々はイメージングのために使用アメフラシは、一般的に 150〜200グラムあり、Marinus Scientificから得られる。
2. ワックス覆われた皿に麻酔動物をピン。注射針は、この目的のためによく働く。無菌テクニックは必要ありません。総鉗子および標準はさみを使用すると、動物の足の切開を行い、口腔内の質量を公開します。頬神経の位置を確認します。すべて頬神経を切断することによって春のはさみと微鉗子、慎重にフリー神経節を使用しています。
3. 神経節を取り出して、人工海水を含むシルガードコートディッシュに入れてください。神経を安定させるために頬の神経が通っていくつかの昆虫ピンを配置。 Desheath細胞内記録のためのニューロンを公開するために極細鉗子と春のはさみ、ようを使って頬の神経節。その後、約15細かい虫（minを使用して再ピンガングリオンutien）ピン。どんな動きが撮像中に問題となるような神経は、所定の位置にしっかりと保持されなければならない。

2。電極を準備

1. フィラメント（例えばWPI TW100F-4）とプラー付きガラスキャピラリーチューブを用いて電極を引き出します。設定は、個々に必要な抵抗の電極を作成するために決定されるべきである。電極は面取り工程を省略し....

Discussion

我々は同時に、細胞内カルシウム濃度を監視し、シナプス伝達の有効性を評価するために用いることができるテクニックを紹介します。これらの技術は、短期可塑性の様々な形態が仲介されているどのように判断するのに役立ちます。

イメージングは​​蛍光顕微鏡とCCDカメラを用いて行われる。ほとんどの機能イメージングのセットアップと比較した場合、これらの機器の要件は比較的控えめです。手法はシンプルで簡単に習得することができます。 CCDカメラで撮像が良い時間分解能を持つ大面積の可視化を可能にしながら、空間分解能が制限されています。したがって、細胞内カルシウムの比較的広範囲または "背景"が増加の役割についての仮説をテストするための有用な技術である。棘における空間分解能および研究カルシウム動態を改善するために、レーザー走査型共焦点顕微鏡、または2光子顕微鏡とカルシウム指示薬カルシウムグリーンを私は可能性プロトコル¹⁰のわずかな変更で使用すること。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬名	会社	カタログ番号	コメント
カルシウムオレンジ	インビトロジェン	C-3013
EGTA	シグマ	E-4378
カルシウム校正バッファーキット	インビトロジェン	C-3008MP	信号の感度とダイナミックレンジをテストするのに便利
塩化マグネシウム六水和物	シグマ	M0250	動物を麻酔する0.33 M溶液で使用

設備名	会社	コメント
FN-1直立蛍光顕微鏡	ニコンインスツルメンツ	ナリシゲと、ITS-FN1ステージ
NMN-21マニピュレータ	ナリシゲ	磁石と一緒にステージに取り付けられた
CoolSNAP HQ 2 CCDカメラ	Photometrics
NISの要素、AR （バージョン3.22）	ニコンインスツルメンツ	イメージングソフトウェアは、蛍光データを取得するために使用
10X/0.3wプランフルーア客観	ニコンインスツルメンツ	この水浸レンズは3.5mmの非常に長い作動距離を持つ
X-Citeの120 PCのメタルハライドランプ	エキスフォ	蛍光イメージングのために使用
LS-DWL ハロゲンランプ	Sumica
ET-CY3フィルターセット	クロマ·テクノロジー	;
パワー1401 A / Dコンバータ	ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン	サンプリングは3 kHzで行われていた
スパイクII （バージョン7.07）	ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン	電気生理学的データを取得するために使用されるソフトウェア
SEC-10 LXアンプ	NPIエレクトロニクス	10Xヘッドステージで使用
モデル410アンプ	ブラウンリー精度	信号を増幅し、フィルタリングするために使用
WS-4	マイナスKテクノロジー	イメージングのための防振
冷却プラットフォーム	カスタムメード	真鍮板に経由氷水を可変速度で励起される