全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

Summary

全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。

Abstract

全反射顕微鏡は、in vitroで、細胞^1を生体内蛍光分子の時空間ダイナミクスを研究するための強力なイメージング技術として浮上してきました。特性臨界角（に近い境界と平行であることにIE）よりも大きい角度で低屈折率と培地中に高屈折率媒質から通過するとき光全反射の光学現象が発生します。すべての光がそのような条件下で反射されていますが、エバネッセント波は距離とともに指数関数的に減衰し、唯一のインターフェイス²の近くに100から200 nmであるサンプル領域を貫通して境界を越えてとに沿って伝播し、作成されます。優れた軸方向の分解能を提供することに加えて、焦点蛍光体のうちの低下励起対雑音比が非常に高い信号を生成し^、2,3退色の有害な影響を最小限に抑えます。広視野のテクニックなので、全反射も高速な画像交流できます。ほとんどのスキャンベースの共焦点顕微鏡のセットアップよりquisition。

一見すると、全反射の低浸透深さは、多くの場合、厚い細胞壁で囲まれている細菌および真菌細胞のイメージングと互換性がないと思われる。それどころか、我々は酵母や細菌の細胞の細胞壁は、実際に全反射の使いやすさを向上させ、観察可能な構造を^4-8の範囲を広げることを発見した。多くの細胞プロセスは、したがって、直接、しばしば強力な遺伝子操作技術を提供する小さな、単一細胞微生物で全反射によってアクセスすることができます。これは、私たちはタンパク質相互作用や活動の動態を直接生きた細胞で評価することができるin vivoで生化学の実験で行うことができます。

ここではサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）または枯草菌細胞のための高品質の全反射画像を得るために必要な個々の手順について説明します。我々はaffeできる様々な問題点を指摘CT TIRFは、細胞内蛍光プローブの可視化といくつかのアプリケーション例と手順を示しています。最後に、全反射画像がさらに確立された画像復元技術を使用して改善することができる方法を示しています。

Protocol

1。試料調製

1. カバースリップの準備
   TIRFは、カバースリップ（ 図1A、映画1）に起因するバックグラウンドシグナルに敏感であるとして、カバーガラスは、ダスト粒子からきれいにする必要があります。
   1. 蓋付きセラミックホルダーに鉗子場所カバースリップを使用します。
   2. 1 MのNaOH（複数回再利用することができます）でガラス容器を埋める。
   3. 低速連続回転（オービタルシェーカー）の下で2時間インキュベートします。過度のインキュベーション（> 8 h）は、不透明なカバースリップを作成します。
   4. 低速連続回転で5分間蒸留水で2回洗浄します。
   5. 100％エタノールで覆わセラミックホルダーに保管してください。
2. 枯草菌細胞を調製
   
   1. 適切な増殖培地5 mlに0.05と指数関数の位相（0.3から0.7のOD _600）に成長- 0.01のOD ₆₀₀に希釈する。
   2. 水や培地中に1.25パーセントアガロースを準備します。バックグラウンド蛍光を低減する合成培地を使用しています。 ℃と72℃の加熱ブロック内店舗95℃で1.5 mlプラスチックチューブに粉を溶かす
   3. 二つ目のスライドのフラットパッドにスライドとプレスの中央....

Discussion

全反射顕微鏡は、画像周辺のタンパク質への選択のテクニックです。エバネッセント場の低浸透深さは、対雑音比が非常に良好なシグナルにつながり、高いフレームレート、または非常に弱く発現したタンパク質のイメージングとデータ収集を可能にするフォーカスライトのうち最小限に抑えることができます。高コントラスト、高フレームレートの組み合わせは、全反射顕微鏡皮質ローカライズされたタンパク質のイメージングの時空間ダイナミクスの最適なツールとなっています。興味深いことに多くの微生物を囲む厚い細胞壁は全反射によって末梢タンパク質のイメージングを妨げることはありません。実際には、一過性の実際の生成は非常に高い細胞壁と原形質膜^5,10との間のインタフェースで発生します。終了した細胞でも酵母細胞⁸に撮像することができ、大きな表面積を説明するかもしれない細胞壁に沿って光の伝播につながる可能性がある光の反射。

TIRF IMの最適な品質のために年齢にもキャリブレーション顕微鏡システムを持つことが重要です。レーザーは、各イメージングセッションの前に集中して調整する必要があり.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ツール/試薬の名前	タイプ	会社	カタログ番号
オービタルシェーカー	ツール	UniEquip	UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
全反射顕微鏡	ティル		カスタマイズ·セットアップ
ガラス容器	ツール	Vitlab	340から232880353
セラミック染色ラック	ツール	トーマス科学。	8542E40
コンカナバリンA	試薬	シグマ	L7647
カバーガラス＃1（18×18ミリメートル）	顕微鏡	メンツェルグレイザー	BB018018A1
顕微鏡スライド	顕微鏡	メンツェルGレーザー	AA00000102E
液浸油	顕微鏡	ツァイス	Immersol 518F
アガロース	試薬	インビトロジェン	16500-500
FluoSpheres	試薬	インビトロジェン	F8795