方法論記事

α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙

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DOI：

10.3791/3999

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2012年5月16日

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1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

この記事について

サマリー

CD4列挙法、α-テストは、迅速かつ正確なCD4 + Tリンパ球数を提供するために唾液を使用していますが記載されている。 α-テストコストのペニーと技術トレーニングなど、モノクローナル抗体、計測機器、冷凍、サンプルの輸送と同様に、血液の収集と処理などの高価な試薬の必要がなくなります。

要約

HIV疾患をモニタリングするためには、安価なCD4数測定法の確立が急務となっています。現在唯一認められている手法である、血中細胞上のCD4を測定するためのモノクローナル抗体をはじめとする試薬のコスト、技術的な専門性、そして時間および温度の制限があるため、資源が限られた地域ではCD4数測定の実施は困難です。コストと時間を削減するための一般的な実験室戦略として、特定の血液値を直接測定するのではなく、計算によって算出する方法があります。例えば、LDLレベルは、総コレステロール、HDL、およびトリグリセリドの測定値を用いて算出されます1。したがって、CD4+ T細胞数を直接的に調節する細胞外の相関因子を特定できれば、その生理学的な関連性に基づき、CD4数を正確に算出する手法を提供できる可能性があります。

血液中に進入し、循環CD4+ T細胞となる幹細胞の数は、細胞の移動能に影響を与えるケモカインCXCL12とその受容体CXCR4によって決定される2。血液中への幹細胞の移動プロセスは、さらに細胞表面ヒト白血球エラスターゼ（HLECS）およびHLECS反応性活性α1プロテイナーゼインヒビター（α1PI、α1アンチトリプシン、SerpinA1）によって調節される3。HIV-1感染症では、疾患プロセスによりα1PIが不活性化される 4。HIV-1感染症の初期無症状群では、未治療のHIV-1患者の100%において活性α1PIが正常値以下であり（中央値=12 μM）、有症状群で正常レベルに達することが判明している4, 5。このパターンは、合成不全や蛋白分解による不活性化、あるいは酸化ではなく、免疫不活性化に起因すると考えられている。CD4細胞数が >220 cells/μlであるHIV-1感染被験者において、CD4数と活性α1PIの血清レベル（r2=0.93, p<0.0001, n=26）および不活性α1PIの血清レベル（r2=0.91, p<0.0001, n=26）に相関があることが観察された 5。HIV-1感染者および非感染者へのα1PI投与により、CD4数が劇的に増加したことから、α1PIが血液中のCD4+ T細胞数の調節に関与していることが示唆された 3。

刺激を加えることで、全唾液中には十分な漿液性滲出液（血管壁を通過して唾液中に流入するタンパク質を含む血漿）が含まれるため、活性型α1PIの測定が可能となり、この測定値との相関は、CD4数を算出するための正確な手法であるという根拠となります。簡潔に述べると、チューインガムやクエン酸などの唾液分泌促進剤が、全口唾液への血清の滲出を刺激します。血清の滲出を刺激した後、唾液中の血清α1PIの活性を、エラスターゼ活性を阻害する能力によって測定します。豚膵臓エラスターゼ（PPE）は、容易に入手可能な安価なエラスターゼ源です。PPEはα1PIと結合して1対1の複合体を形成し、これによりPPEが特定の基質を切断することを妨げます。その基質の一つが、比色ペプチドであるサクシニル-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-ニトロアニリド（SA3NA）です。唾液を飽和濃度のPPEと共に室温で10分間インキュベートすることで、唾液中のすべての活性型α1PIにPPEが結合します。活性型α1PIによるPPEの阻害結果は、PPE基質であるSA3NAを添加することで測定できます(Figure 1)。CD4数は血液量（CD4 cells/μl）として測定されますが、唾液量は一日中、また個人間で大きく変動するため、唾液中のα1PI濃度は唾液量ではなく、唾液中の血清濃度に関連しています6。しかし、唾液中のタンパク質のほぼすべては血清成分によるものであり、唾液のタンパク質含有量は測定可能です7。したがって、唾液中の活性型α1PIは、唾液タンパク質含有量に対する比率として算出され、これをα1PI指数と呼びます。ここに提示する結果は、α1PI指数がCD4数を算出するための正確で精密な生理学的手法であることを示しています。

プロトコル

1。新鮮なワーキング溶液を調製

  1. TBS：0.05 MトリスpHは7.8（TBS）、緩衝生理食塩水。 60ミリリットルTBS /マイクロプレートを準備します。
  2. PPE：ブタ膵臓エラスターゼ、タイプ1（PPE）は、懸濁液として提供されています。よく振って約0.01 U / mlのTBSでPPEを希釈する。 6ミリリットルワーキング溶液/プレート）を準備します。
  3. SA 3 NA：スクシニル-L-Alaの-L-Alaの-L-Alaの-p-ニトロアニリド（SA 3 NA）。ジメチルスルホキシド（DMSO）に0.1 M株式SA 3 NA溶液を調製し、-20℃で直ちに使用するか、または保存する株式SA 3 NA溶液をTBSで1/100に希釈して6ミリリットルワーキングソリューション/マイクロプレートを準備します。
  4. クーマシーブルー：TBS 10％クーマシーブリリアントブルーR-250（シーブルー）のストック溶液を調製し、-20℃で直ちにまたはストアを使用しTBSに原液1/1000希釈して6ミリリットル作業溶液を調製します。

2。唾液を準備します。

  1. 唾液採取：立った姿勢では、このような口の中でクエン酸またはチューインガムとして唾液分泌促進薬を配置することによって、唾液中に血清滲出を刺激する。無糖レモンドロップは頻繁に歯と歯茎をかむことができないHIV-1患者のために便利です。最初の3分間、必要に応じて飲み込むと、次の3分間に覆われたカップに口全体に唾液を収集します。これにより、唾液の約2ミリリットルを提供します。 -80℃で直ちに使用や保管℃、
  2. 唾液処理：37℃で凍結、融解試料℃、氷上に置いた場合。 2月4日で新鮮なまたは融解試料を保存°C 3日間を超えない。渦唾液をないし、血清滲出液が含まれていませんムチンピペッティングは避けてください。唾液取り扱う際には標準予防策を使用してhttp://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdfを 。

3。マイクロプレートのセットアップ

  1. BUFFER：測定は三重で行われます。マイクロタイタープレートの各ウェルに130μLTBSに追加されます。
  2. 検体：各テストによく、150μl/ウェルの最終容量20μLの唾液に追加されます。気泡を導入することなく、ピペッティングにより混和する。
  3. コントロール：陽性対照PPEが含まれていません、しかし、唾液。ネガティブコントロールは、唾液が含まれていますが、よくないPPE.To陽性対照は20μLTBSが追加されません。ネガティブコントロールによく20μLの唾液に追加されます。
  4. PPEのインキュベーション：PPEワーキング溶液をよく振ってください。よくネガティブコントロールのウェルを除く各50μLPPEワーキングソリューションを追加します。ネガティブコントロールのウェルに、50μLのTBSを追加します。 23℃で10分間インキュベートする。
  5. 基板のインキュベーション：各ウェルに50μLSA 3 NAワーキングソリューションを追加します。 23℃で45分間インキュベート
  6. クーマシーブルー：50μLクーマシーブルーワーキングソリューションを追加する
  7. 読出し：タンパク質含有量を表してクーマシーブルーを検出するためにアクティブなα1 PIおよび595 nmを表すSA 3 NAの切断を検出するためにマイクロプレートリーダー、405 nmで吸光度を測定します。

4。 α1 PI指数を計算する

  1. 平均 405 nm と 595 nmのを正規化 ：それぞれの三重は、平均を計算します。標本平均値から陰性コントロールの平均値を減算します。プレートからプレートの変動を​​最小限に抑えるために、次のようにポジティブコントロールの平均値によって、各標本の平均値で割って平均値を正規化する。

figure-protocol-1

  1. α1 PI INEXを計算します。正規化された595 nmの正規化405 nmで割ります 。

figure-protocol-2

5。代表的な結果

風土病、資源の限られた地域でのCD4数を監視するためのポイントオブケアのスクリーニングテストとしてα-テストでは、使用に適している可能性があるかどうかを決定するために、刺激唾液は、20の女性から採取されたと11男性のHIV-1の被験者参加診療所のためにカメルーンのルーチンケア。ニューヨーク市で収集した唾液を用いたα-テストの開発時には予備的観察と一致し、唾液中のα1 PI指数は、CD4数（R 2 = 0.91、P <0.0001、N = 31）と相関してカメルーンで収集された。関係は、用量反応関係（図2A）と一致している3パラメータシグモイド曲線によって定義されています。 95％の信頼区間と予測区間は、それぞれ青と赤の線（図2B）に描かれています。

で以前の研究で、我々は、CD4 + T細胞は周期23の正弦波サイクリング±HIV-1患者におけるα1 PIの欠乏（PIZZ 3）の継承したバージョンの被験者で3.5日を示すことが判明しました。描かれた本書は、27日周期（図3A）を示す非HIV-1健康なコントロールでサイクリングCD4のコンピュータで生成された正弦曲線分析の代表例である。

CD4 + 6科目のT細胞の変化をコンピュータで生成された正弦曲線の分析は、ピーク·ツー·ピーク振幅と振動の3軸の値が得られた。期待されるように、振動の軸は振幅と相関した（r 2 = 0.96、P = 0.009、n = 6）は（ 図3B）。患者のする低CD4 T +細胞数は、CD4 T細胞数の周期的変化は小さかった、高いCD4 + T細胞数の患者では、周期的な変化が大きかった。

から図2に示した回帰直線は、振動と振動の軸の軸は振幅がために変化することにより、回帰直線のCD4 + T細胞が予想されるどのくらいの上下に推定する回帰直線を計算することができ、振幅と相関していると推定サイクリング（ 図3C）。図3C及び図2Bに計算された信頼区間で計算された振幅重ね合わせ、その振幅は（緑線）95％以内であることが判明した信頼区間（青線）（ 図3D）。

figure-protocol-3
図1。手順の概要：口の中に置き、クエン酸と唾液を収集します。三重のマイクロプレートのウェルに希釈した唾液を追加します。各ウェルにPPEを追加し、23℃で15分間インキュベート各ウェルにPPE基板を追加し、23℃で45分間インキュベート。クマシーブルーを追加して、PPEのアクティビティを検出し、595 nmでタンパク質を検出するために405nmで読み取る。

figure-protocol-4
図2。標準的なCD4列挙法によるα-テストの比較。 A）α-テスト刺激全体の口の唾液中にα1 PI指数を定量することにより行った。 CD4数は、標準的なフローサイトメトリーを用いて独立した医療研究室で行った。フローサイトメトリーと唾液の血液は、同じ診療所の訪問で集めた。 B）95％信頼区間と予測区間は、青と赤で描かれているα1 PI指数とCD4数が3パラメータシグモイド曲線（R 2 = 0.91、P <0.0001、N = 31）で定義されています。との関係それぞれの行、。

figure-protocol-5
図3。計算CD4の精度は、Cα1PIIndex.Aを使用してounts）は、CD4 + T細胞は、非HIV-1健常対照の27日周期の正弦波サイクリングを示した。振動の軸が描かれている（赤い点線）。B）T細胞の循環が4 HIV-1の被験者において振動のピーク·ツー·ピーク振幅と軸を計算するために使用されたCD4、1非感染のコンピュータ生成された正弦波の解析-1 PIzzの件名、および部品AにCD4との関係を示した非HIV-1健常対照T +細胞の振幅と振動の軸は3つのパラメータシグモイド曲線（R 2 = 0.96、P = 0.009、nで定義されています= 6）。C）パートB）で得られた振動の振幅と軸の間にS字型の関係は図2の回帰直線（黒線）に沿った点の予想される振幅（緑線）を計算するために使用されていました。D）予想される振幅間隔（緑線）は95％信頼区間（から有意に異なっていたとしてマンホイットニー順位和検定と振幅線と回帰直線（37セル間の中央値の差（95％信頼区間と回帰直線（63個/μLの間の中央値の差の比較に基づく）によって決定された青線） /μl）を、P = 0.001）。

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ディスカッション

原液血清は、中央値36μMを含むα1 PIおよび3.6μMα2マクログロブリン（α2 M）の10倍の差が8。両方のタンパク質は、PPEへの結合について競合します。これら二つの特性、濃度、PPE親和性は、特にM 8α2、競合の存在下で正常な血清中のα1 PIを測定することができる方法を開発するために利用されています。このメソッドは、0.3％の血清中ではわずか50 nMのμ1 PIを検出することができます。 2.5％の血清希釈で、PPEへのα2 Mの結合は検出されなくなり、この希釈は、約900nmのα1 PIと90 nmのα2 Mを含まれています

α2 Mより10倍以上のα1 PIで構成されている血清とは対照的に、全体の口の唾液は、20倍の差が9を含んでいます。我々は、刺激唾液、原液...

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開示事項

利害の衝突が宣言されません。

謝辞

研究では、ハリーウィンストン研究財団によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号
唾液分泌促進薬、0.05Mクエン酸 EDAのSugarfreeキャンディーズ、4900リアN.20thストリート、フィラデルフィア、PA 19144 シュガーフリーレモンドロップ
ブタ膵臓エラスターゼ、1型（EC 3.4.21.36） Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO 63103 E1250
スクシニル-L-Alaの-L-Alaの-L-Alaの-p-ニトロアニリド Sigma-Aldrich社 S4760
クマシーブリリアントブルーR-250 Sigma-Aldrich社 B7920
組織培養処理し、96ウェルマイクロプレートベクトン·ディッキンソン、フランクリンレイクス、NJ 07417-1886 35から3072
405 nmと595 nmのフィルター付きマイクロプレートリーダー MTXラボシステム、8456コネクタ、道路、ブイlding D、ウィーン、バージニア州22182 ダイネックスP97277

参考文献

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