ラットとマウスにおける卵巣摘出および17β-エストラジオールの交換：ビジュアルデモ

サマリー

シラスティックカプセル及び経口ヌテッラによる卵巣摘出および17β-エストラジオールの後続の置換は、ラットとマウスで実証されています。

要約

エストロゲンは、効果の非常に広いスペクトルを持つ女性の性ホルモンのファミリーである。ラットとマウスはエストロゲンの研究で使用されている場合、それらは一般的に17β-エストラジオール外因性の代わりに、急速にサイクリングホルモン産生を切除するために、卵巣摘出されています。ホルモンは生理的な血中濃度を得るために投与されるべきである方法に関するコンセンサスの欠如が、しかし、があります。 17β-エストラジオールレベル/管理方法が深く、実験結果は^1-3に影響を与えるので、これは非常に重要です。我々は、皮下シラスティックカプセル単位および経口ナットクリームヌテッラは、市販の徐放ペレット（アメリカの会社の革新的な研究によって生成される）よりも優れているという発見は、17β-エストラジオール投与の異なるモードを特徴とする一連の研究であり、 17β-エストラジオール^4-6の生理的血 ​​清濃度を生産の面で毎日注射。 ADVの中以前にブプレノルフィン投与⁷で使用されているナッツクリームの方法、のantagesは、エストロゲンの投与のために使用した場合には経口ホルモン補充療法に似ており、非侵襲的であるということです。皮下シラスティックカプセルは便利であり、最も安定した血清中濃度を生成します。このビデオの記事は、管理手順の重要な側面の議論に続いて卵巣摘出ラットおよびマウスのシラスティックカプセル及び経口ヌテッラによる17β-エストラジオールホルモン補充のステップバイステップのデモが含まれています。

プロトコル

1。背側経路を介して卵巣摘出

1. 酸素/亜酸化窒素30％/ 70％の混合物中にイソフルラン1.5％（誘導のための4％）の使用例については、動物を麻酔。直腸温度計に接続された加熱プレート上に腹臥位で動物を配置します。それは動物とプレート間の絶縁の薄い層を持つことが重要であり、温度計フィードバックシステムは、±0.5 37℃内で体温を保持する目の保護のためにゲルを適用し、術後の疼痛緩和のための動物の首の外側面に皮下に生理食塩水で希釈した5 mgのRimadyl / kg体重を管理します。
2. 腸骨稜からcephally 4×4センチ（マウスの3 * 3 cm）のエリアを剃る。徹底的に4×4 cmの開口手術のシートを持つ動物をカバーする前に、例Jodopaxために剃毛したエリアを洗います。
3. 2〜3センチメートル正中切開を行い、ぶっきらぼうに、基礎となる筋膜から皮膚を解剖する。正中線の左右いずれかのCMが、別の切開のthroを作る筋膜ぐふっ。ぶっきらぼうに腹腔内に到達するまでなど、表面的に可能な限り、この筋膜の下に横方向に解剖する。
4. ピンセットを使用して、腹腔内に卵巣を取り囲む脂肪組織をつかみ、静かに引き出します。卵巣を識別し、子宮角とこの構造体の近位血管0.5〜1センチメートルを連結。卵巣と連結された脂肪組織を切り取り、腹腔内に残っている組織のバックを入れた。反対側の筋膜内の別の切開を行い、手順を繰り返します。
5. 好ましくは、モノフィラメント縫合糸を使用して、傷を閉じて、麻酔から覚醒動物​​ましょう。手術後少なくとも2時間の間に加熱されたケージ（25-27°C）に動物を配置します。動物は、術後最初の数日間別々に収容する必要があります。それはケージは頻繁に回復期の間に清掃/交換されている極めて重要である。手術24時間後には、で希釈した別の5 mgのRimadyl / kg体重を皮下に動物を注入する生理食塩水。

2。シラスティックカプセルを通じて17β-エストラジオールの皮下投与

1. 徹底的にゴマ油で17β-エストラジオールの所望量を混ぜる。ラットおよびマウスの生理的濃度のために、私たちはそれぞれ180μg/ mLとし、μg/ mLの18から36をお勧めします。プラセボカプセルは純粋なごま油で満たされている。
2. 3センチメートル（マウス2 cm）のシラスティックチューブの長さおよび5mm（マウスの3 mm）をプラグインするための木製のアプリケーター棒の長さをカットします。鉗子を用いて、全体の長さを埋めるために17β-estradiol/sesame油溶液を注入する前に、シラスティックカプセルに1木製のプラグを絞る。静かに別の木栓（プラグがカプセルに永久に残ることになっている）で開放端にシラスティックカプセルをキャップ。注入前に一晩の残りの17β-エストラジオール溶液中でのカプセルをインキュベートします。
3. カプセルの注入は、ラットの卵巣摘出で使用される麻酔中に実行することができます。マイルのためにCEは、しかし、卵巣摘出後14日間の回復期間が強く脆い皮膚から突き出ているカプセルのリスクを最小限にすることをお勧めします。
4. 1.1のように手術の準備の後、または卵巣切開を閉じた後に、動物の首の背側面に2×2 cmの領域を剃ると洗ってください。 1cmの切開を行い、ぶっきらぼうにカプセルのための十分なスペースで、caudolaterally皮下ポケットを解剖。シラスティックカプセルを拭く（この時点まで、17β-エストラジオール溶液中でインキュベートされたことを）ゆっくりと、その後縫合糸で閉じられて切開を介してそれをインストールしてください。それは確認するために極めて重要であること、特に傷に近い領域で、できるだけ少ないようにカプセル株は皮膚、。カプセルの生産から注入まで、それは汚染が回避されることが重要です。

3。ナットクリームヌテッラを経​​由して17β-エストラジオールの経口投与

1. 完全に溶解する17β-ヌテッラとごま油を混ぜた後ごま油でエストラジオール、と。私たちは、それぞれの日常の部分は17β-エストラジオール28μgの、5μLごま油ラットおよび各30グラムのマウス1.12μgの17β-エストラジオール、0.312μLごま油と60mgのNutellaのための体重1kgあたり1gのヌテッラが含まれていることをお勧めします。プラセボナットクリームは、17β-エストラジオールないことを除いて同じように用意されています。
2. 実験前に5日間ホルモンフリーのナットクリームを食べるために動物を訓練する。訓練の最初の3日間、ラットは最適自宅のケージ内のグループ（2-5動物に約0.5 gのヌテッラ）で訓練を受けるべきである。トレーニングの4番目と5番目の日に、動物実験の状況に似ている毎日の部分を受信する前に別のケージに入れられます。
3. 実験中に、動物はNutellaの部分は小型のセラミックタイルに提供された後、すべての給紙時に別々のケージに入れられます。訓練は、上記のOとして実行されている場合URの経験は、ラットやマウスの95％以上は、ナットクリームを受け入れて、一度完全に慣れて、動物のほとんどは数秒以内にそれを消費することです。

4。代表的な結果

現在の方法で再現することを目的と生理的血 ​​清17β-エストラジオール濃度は、ラットおよびマウスの^4,6 5-35 pg / mLのために約5から140 pg / mLのです。皮下シラスティックカプセルは、上記の指示に従って、300グラム雌Sprague-Dawleyラットに投与した場合、徐々に約40 pg / mLの2日目からは10 pg / mLの35日に17β-エストラジオール血清濃度を減少させる生成します。しかし、すぐに投与した後、1000 pg / mLの周りの血中濃度のピークは^4,5（ 図1A）8時間以内に生理的範囲に落ちて、期待できます。 25グラム雌C57BL / 6マウスに投与した36μgの17β-estradiol/mLと、上記のマウスのシラスティックカプセルは、血清濃塩酸をレンダリングゆっくりと約90 pg / mLの2日目から25 pg / mLの日35に減少entrations。これは（ 図^{1B）6 を}検討されていないが、ラットで発見されたとして、これはおそらく同様のピークが付いています。

用量で経口Nutellaの方法は、300グラム雌Sprague-Dawleyラットに投与した場合、上記の10から70 pg / mLの（ 図^2A）4との間の毎日の変動と17β-エストラジオールの生理的レベルをレンダリングします。上記の用量を用いたマウスでは、日常のレベルは約20〜120 pg / mLの（ 図^2B）6との間で変動します。

ロン>図1ラットの17β-エストラジオール濃度を（; n = 10で、後でポイントで24時間は、n = 15までの時間ポイントアップ）で提示する定型化されたグラフである^。4,5およびマウス（B、N = 10）カプセル移植後^6。シラスティックカプセルは、短い初期、1000 pg / mLのへの血清中濃度のピークが、100 pg / mLの下のレベルへの時間以内に減少を生成します。今後4-5週間では、カプセルは安定し、着実に減少するものの、血清中濃度を得ることができます。網掛け部分は、それぞれ、雌のラットとマウスにおける生理的17β-エストラジオール血清濃度に対応しています。視覚的にグラフで示されていませんであっても、個体間変動は（非常に低い平均27日から、ラットの183パーセントに、28からシラスティックカプセル法によるマウスの115％の変動係数をレンダリングし、17β-エストラジオール濃度で存在し濃度は頻繁に）変動の高い係数を生成します。

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図2ラットの17β-エストラジオール濃度を提示する定型化されたグラフ（A; n = 15）で⁴およびマウス（B; n = 10）のNutellaの毎日のホルモン投与の結果として^6。経口Nutellaのメソッドは、皮下または静脈内投与方法により製造されたとして高いしかし、しないことにより、これまでのところ、毎日のピークをレンダリングします。これは人間のホルモン補充療法の薬物動態を模倣し、経口治療は上記の例では、最初の96時間を提示している場合でも、必要なだけ長くするために進むことができます。網掛け部分は、それぞれ、雌のラットとマウスにおける生理的17β-エストラジオール血清濃度に対応しています。にもかかわらず、視覚的にグラフで示されていません、個体間変動は（非常に低い平均濃度Nutellaのメソッドを持つマウスではラットの40から132パーセントから、13から219％に変動係数をレンダリングし、17β-エストラジオール濃度で存在し多くの場合、高い生成変動係数）。

ディスカッション

以前の研究を持っている上に示した管理モードでは、17β-エストラジオールの生理的血清濃度を生産の面で商業徐放ペレット、注射よりも優れて証明した。徐放ペレットは非常に高く、長時間の血清濃度のピークを生成しながら、注射剤は、極端な、毎日のホルモンの変動を引き起こし、動物^4-6の繰り返しストレス処理を必要とします。適切な管理モードを選択することの重要性は、低用量の17β-エストラジオール投与レジメン（例えば、現在の記事で紹介したテクニックなど）脳虚血^8-10を保護しながら、17β-エストラジオール濃度はによって生成されたことを示す最近の研究で強調表示されます商業用徐放ペレットは、実際には脳損傷^1,2,11-14を増やすこと^{ができます} 。飲料水の管理と強制経口投与は、テストされた2つの他、それほど頻繁に、メソッドです。管理すべてではほとんどの動物の処理は必要ありませんので、飲料水を介したホルモンは、非常に非侵襲的であるその最大の利点を持っています。しかし、17β-エストラジオールは、乳化剤なしで水に可溶ではありませんが、個々の水分摂取量を制御する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Rimadyl、50 mg / mLの	ファイザー	462986	卵巣摘出後の術後鎮痛。
Lubrithalアイジェル	レオ研究所		手術中の眼の保護。
Jodopax獣医	Pharmaxim		外科消毒。
Vicryl 4から0縫合糸	ジョンソン·アンド·ジョンソン		傷の縫合と卵巣結紮。
17β-エストラジオール、> 98％	シグマ	E8875-1G	シラスティックカプセルとNutellaのためのゴマ油で。
ごま油	シグマ	S3547-1L	17β-エストラジオールを溶解する。
シラスティックチューブ、内径/外径：1.575/3.175ミリメートル	ダウコーニング	508から008	シラスティックカプセルの製造。
木製のアプリケーター·スティック	Selefatrade	12から0783	シラスティックカプセルのキャップ。
ヌテッラ	フェレロ		17β-エストラジオール経口のための媒体。