リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Summary

ここでは今定期的に安定的に結合したリボソーム新生鎖複合体（のRNC）を分離するために使用される手法について説明します。この手法は、17アミノ酸長いSECM "逮捕シーケンスは"原核生物の翻訳伸長を停止することができるという発見を利用しています（ E.大腸菌実質的に任意のタンパク質（またはC末端に融合させた）に挿入された）システムでは、。

Abstract

広範な研究は、細胞内のタンパク質のフォールディングの共同翻訳プロセス^1から5であることを示唆している十分な証拠を提供しています。しかし、その機能的なフォームを実現するための共同翻訳折りたたみ時のポリペプチド鎖が続くことを正確な経路はまだ謎です。このプロセスを理解し、共同翻訳の折り畳み中間体の正確な立体構造を決定するために、それは彼らのさらなる構造解析を可能にするために所定のサイズの新生鎖を保有するRNCの分離を可能にする技術を開発することが不可欠です。

SECM（分泌モニター）は、170アミノ酸E.です。 SECM-セカオペロン⁶の下流セカ（分泌駆動）ATPaseの発現を調節する大腸菌の蛋白質。 Nakatogawaと伊藤は当初、SECMタンパク質のC末端領域17アミノ酸長いシーケンス（150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166）への十分かつ必要であることがわかったこれにより、安定したリボソームのP部位^7-9結合したペプチジル-グリシル-tRNAを生成する、Gly165でSECM伸びの停滞が発生します。さらに重要なのは、それはこの17アミノ酸長いシーケンスは、このように所定の大きさ⁷の新生鎖を保有するRNCの生産を可能にする事実上すべてのフルレングスおよび/ ​​または切り捨てられたタンパク質のC末端に融合させることができることがわかった。したがって、標的タンパク質に融合または挿入したときに、SECMストールシーケンスは、ポリペプチド鎖の伸長の逮捕を生成し、E.の in vivo の両方で安定したRNCを生成する大腸菌細胞と無細胞系の in vitro インチショ糖密度勾配遠心法は、さらにRNCを分離するために利用されています。

孤立したRNCは、共同翻訳の折り畳み中間体の構造的および機能的特徴を分析するために使用することができます。最近、この手法は成功した^10,11、いくつかのリボソーム結合した新生鎖の構造への洞察を得るために使用されている。ここでは、ウシγ-BクリスタリンのRNCの分離SECMに融合し 、in vitro 翻訳系で生成について説明します。

Protocol

1。 DNAテンプレートの調製とin vitro転写

1. 目的の遺伝子は、任意のT7および/または、例えばプラスミドに基づくSP6プロモーターに複製されます。興味のあるRNCを得るためには、標的ポリペプチドのC末端は、SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP ⁷の逮捕誘導シーケンスを追加することによって拡張されています。目的のポリペプチドフラグメントは、リボソームトンネルの外に押し出すことを保証するためには、標的タンパク質のC末端部分は、少なくとも30のアミノ酸^12から14によって拡張する必要があります。柔軟性のグリシン - セリン豊富なリンカーは、すべての可能なコンフォメーションの制約を回避するために、タンパク質とSECM逮捕·シーケンスの間に導入することができます。
2. in vitro転写では、テンプレートDNAは、ORFの下流を切断する制限酵素で直線化されるべきである。一つは、アガロースゲル電気泳動で制限酵素消化製品を実行することにより、プラスミドDNAの完全な線形化を確認する必要があります。
3. 線形化されたプラズマidは、さらにin vitro転写反応のために使用されます。テンプレートDNAの異なる濃度は 、in vitro転写のために必要な最適なDNA濃度を識別するためにテストすることができます。一般的にAmbion....

Discussion

再現可能な結果を得るためには、in vitro転写と翻訳のために使用されるコンポーネントの品質と濃度が非常に重要です。慎重に処理した場合、我々は、in vitro転写と翻訳の抽出物で市販されている使用していると、彼らは効率的かつ再現可能な結果を与える。 mRNAの品質は翻訳に影響を与えることがないので、in vitro翻訳のためにそれを使用する前に、mRNAの整合性をテストするために最も重要である。 in vitro翻訳のためのインキュベーション時間は、タンパク質の長さによって異なります。また、遠心分離の時間/速度は場合には、70Sリボソーム画分をうまく解決されていないと50Sから分離し、それに応じて調整することができます。さらに、リボソーム結合タンパク質複合体は、RNaseのコンタミを避けるために慎重に処理する必要があります。また、バッファの状態を注意深く監視する必要がありますおよびMg ^{2 +を}キレートするかもしれませんキレート剤は避けるべきである。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/キットの名前	会社	カタログ番号
MEGAscript T7高収率転写キット	Ambionの	AM1333
RTS 100大腸菌HYキット	5内閣総理	2401100
リボヌクレアーゼ阻害剤	インビトロジェン	15518012
トランス[35 S] -ラベル	MPのバイオメディカル	0151006
アミコンウルトラ-4遠心式フィルターユニット	ミリポア	UFC801008
貯蔵燐光体オートラジオグラフィー	GEヘルスケア	台風9410可変モードイメージャ
密度勾配分画システム	ダインイスコ株式会社	ISCOプログラマブル密度勾配系
スクロース勾配CENtrifugation	ベックマン·コールター	オプティマL-90 K取超遠心