方法論記事

の調査のための人間の卵管モデル

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DOI：

10.3791/4036

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2012年8月11日

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1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

この記事について

サマリー

我々は、説明します ex vivoでの感染モデル。全体の臓器組織モデルは、調査するために設立されました C.トラコマチス誘導病理。

要約

クラミジアトラコマチス（C.トラコマティス ）と生殖器感染症は最も頻繁には、世界中の女性に性的に病気を送信されます。病原体の非効率的なクリアランスや永続性は上部生殖管の感染を昇順と感染組織1,2に慢性炎症性損傷を引き起こすことになっているにつながる可能性があります。その結果、骨盤内炎症性疾患（PID）、卵管閉塞と不妊のような重篤な臨床的後遺症は3,4を発生する可能性があります。

Cとの研究のほとんどクラミジアは、上皮細胞株（例えば、HEp-2細胞およびHeLa-229）または、マウスで実施されている。しかし、細胞培養ベースのモデルと同様に、彼らはどちらもネイティブの組織の生理機能やCの病態を反映しません。 in vivoで 5 のクラミジア性器感染症。さらに制限が事実によって与えられている中央のシグナル伝達カスケード（例えば、IFN-γmediat細胞内のクラミジア増殖を制御ED JAK / STATシグナル伝達経路）は、基本的にマウスとヒト6,7の間で異なる。我々や他したがって、Cの間の直接的な相互作用を調査するために全体の臓器卵管モデルを確立クラミジアと人間の卵管細胞のex vivoで 8,9。

この目的のために、子宮摘出術を受ける女性からのヒト卵管は、Cで収集し、感染したトラコマチス 24時間感染後以内に血清D.、 クラミジア·トラコマチスを検出するために走査型電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて分析試料は同様にCなどの上皮損傷を媒介卵組織内のクラミジア封入体形成。

プロトコル

1。 クラミジア·トラコマチス血清型Dストックの調製

  1. 4ミリリットルCとしたHeLa-229細胞を含むコンフルエント175cm 2の細胞培養フラスコを感染させるバッファをSPGのでクラミジア D。
  2. 一定の揺れの間に37℃で1時間インキュベートする。
  3. 10％FCS、240μlのシクロヘキシミドと20ミリリットルDMEMを追加します。
  4. °C、5％CO 2、37で48時間加湿インキュベーター中でインキュベートします。
  5. C.をデタッチし、破壊するために、5 mlの滅菌ガラスビーズ、強い揺れを追加します。 HeLa細胞-229細胞をかくまっトラコマチス 。
  6. 上清を収集し、滅菌したガラスビーズの別の5ミリリットルを追加します。
  7. 1分間ロック三回は、すべてのHeLa-229細胞を破壊し、リリースCにトラコマチス 。
  8. 1000年RPMIと4で5分間遠心°C細胞の破片を取り除くために。
  9. コンフルエントgをフラスコ8から10 175cm 2の培養細胞の感染上清を回収HeLa細胞229細胞とrown。
  10. 4 mlのSPGバッファと37℃で一時間前の​​感染から4 mlの上清°一定に振とうしながらCを持つすべてのフラスコをインキュベートします。
  11. 1時間10％FCS、37℃、5％CO 2で48時間インキュベートし、続いて230μLシクロヘキシミドと15ミリリットルDMEMを追加した後。
  12. 5ミリリットル滅菌ガラスビーズを追加し、Cを切り離し、破壊するために振るHeLa細胞-229細胞をかくまっトラコマチス 。
  13. 上清を収集し、滅菌したガラスビーズの別の5ミリリットルを追加します。
  14. 1分間ロック三回は、すべてのHeLa-229細胞を破壊し、リリースCにトラコマチス 。
  15. 4 1000 RPMIで5分間遠心°Cは、細胞の破片を取り除くために。
  16. 上清を収集します。
  17. 50ミリリットルのファルコンチューブに上清を40ml、11000 RPMI 99分間遠心を記入してください。
  18. 遠心分離後、上清を捨て、1 mlのSPGバッファーでペレットを洗浄する。
  19. ホモジナイズペレット-70 1、5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ、店舗°Cを使用するまでに1 mlのSPGとアリコートを20μlインチ準備された株式の生物学的活性が確立されたHeLa-229細胞感染モデルにおいて確認された。

2。ヒト卵管の調製

  1. すぐにRPMI準備まで、4で抗生物質を含まない°C、5％FCSを含むで手術後に子宮摘出術を受ける女性から店のヒト卵管（HFT）。プロトコルは、リューベック大学（09から153）の倫理委員会によって承認されました。研究に含まれていた女性（53歳まで34）は前のCの既往はなかったクラミジア感染症。卵管の組織は、帝王切開時または黄体期に症候性子宮筋腫による子宮中の母親のリクエストに応じて周産期滅菌で採取した。すべてのHFTは、Cに対して陰性であったPCR法によるクラミジア 。
  2. を含むRPMIを含むペトリ皿にHFTを分析抗生物質を含まない5％FCS。全体の処理中に組織が乾燥を防ぐために、メディア内に浸漬する必要があります。
  3. カットオフと手術中に破壊された結合組織と組織を破棄します。
  4. 解剖した後に小さなメスで慎重にHFTを開きます。
  5. さらなる実験が1cm×1 cmに0.5cmの大きさに×0.5 cmの組織片を準備します。
  6. 抗生物質を含まない5％FCSを含むRPMI 1ミリリットルの感染ストアHFT標本のために。 HFT検体はC.の5.5x10 5 IFU（インクルージョン形成単位）に感染していたトラコマチス 。
  7. 37 HFT試料をインキュベート°C、5％CO 2、21％O 2と同様に37°C、5％CO 2および2％で24時間O 2。
  8. インキュベーション時間の後に4で少なくとも3日間モンティの固定の標本や店舗を集める°SEM / TEMの準備までのC。

3。 TEM用HFT試料の調製

  1. のためにTEMはモンティの固定から標本を削除して、4×5 mmの部分に2×2ミリメートルを切る。残りの組織は、SEMに使用することができます。
  2. 1時間カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35の部分を洗う。
  3. アクアdestに1％（w / v）の四酸化オスミウムでインキュベートする。一晩。
  4. カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35で6x5分を洗浄することによって過剰な四酸化オスミウムを削除します。
  5. 水の中のエタノールの濃度を増加させ（v / v）の（2時間で30％、2時間、40％、2時間の50％、2時間で60％、夜70％以上、2の80％でインキュベートすることにより水を除去H、1時間の90％、1時間の95％、1時間の100％。
  6. 酸化プロピレンの2×15分間エタノールを洗い流し、その後、50％の混合物（v / v）のプロピレンの新たに調製したアラルダイト（すべてのコンポーネントを含む）に転送し、一晩インキュベートする。
  7. 少なくとも1時間、新たに調製したアラルダイト（すべてのコンポーネントを含む）に転送されます。
  8. 平坦な埋め込み金型に移し、アラルダイトで記入してください。
  9. アラルダイト硬化のためにしましょう60°Cで少なくとも48時間
  10. 埋め込まれたサンプルのトリミング後のガラスナイフまたは基くダイヤモンドナイフを使用して、ウルトラミクロトームで、半薄切片（700 nm）をカットし、リチャードソン染色で染色される。
  11. ダイヤモンドナイフと銅グリッド（例えば150平方メッシュ）への転送を用いた超薄切片（約70 nm）を切り取ります。
  12. アクアdestに0.5％（w / v）の酢酸ウラニルで超薄切片を染色する。 3％（w / v）のアクアdestにクエン酸鉛に続く。自動セクション·シュタイナーインチまた、セクションはアクアdestに酢酸ウラニルの飽和遠心分離ソリューションにグリッド15分を残して、手動で染色することができます。アクアdestに0.3％クエン酸鉛（w / v）に続く。

4。 SEMのHFT検体の調製

  1. SEMのためにモンティの固定、1.5×1cmのコルクシートや昆虫針を使用してフィックスの位置で上向きに直面している上皮と東洋から標本を削除します。
  2. 適当な金属バスケットにコルクに試料を移し、カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35で30分間洗浄する。
  3. アセトン/水混合物の濃度の増加（v / v）の6時間で30％、6時間の40％、8時間で60％、夜70％以上、2時間、80％、90％の試料をインキュベートすることによって水を除去一晩で2時間、100％（試料が連続的に水没しておくことは非常に慎重である）。
  4. 臨界点乾燥（温度40℃、圧力80バール）により新鮮な100％アセトンおよび乾燥標本に転送されます。
  5. 導電性カーボンセメントを用いた導電性カーボンのタブを備えたSEM試料マウントに上向き上皮で針、コルクと接着剤の試験片を取り外します。マウントと導電性カーボンのタブの間に導電性を高めるために液体の導電性の銀を使用しています。
  6. スパッタコーターを用いて試料の導電性白金、金またはパラジウムコーティングを準備します。

5。リチャードソンのステインセミ薄切片の染色

  1. スライド上半薄切片を乾燥させます。
  2. 1〜2分間60℃で染色溶液でセクションを染色。
  3. アクアdestに洗ってください。
  4. 乾燥したセクションとカバースリップ。

6。代表的な結果

人間の卵管の感染症モデルの中で我々は、非感染コントロール（ 図1）とCの間の上皮形態の違いを視覚化することができましたマティス -正常酸素条件下で感染したチューブ（ 図2）。特徴的な形態の違いが非感染コントロールでは検出できなかった卵管上皮細胞の病原体誘起膨潤および溶解を示唆した。半薄切片を透過型電子顕微鏡を用いて、我々は細胞内のCを証明することができました非感染コントロール（ 図4）にヒト卵管組織（ 図3、5）感染はなく、ex vivoでのクラミジア封入体形成。酸素濃度として女性の生殖管のtionsは、我々はまた、低酸素条件下で我々のモデルを検討し、炎症過程で生理的条件下で11、さらに減少の下で既に低くなっています。予備的な結果は、モデルが酸素濃度を変化させることでクラミジアの成長と子孫を分析するのに有用であることを示します。クラミジアによって誘導される上皮細胞の損傷は感染症（ 図6）の前に卵管の無謀な準備と処理を介して媒介される成果物から分離する必要があります。

figure-protocol-1
一日のインキュベーション後、非感染ヒト卵の図1走査型電子顕微鏡（SEM）は、コントロール培地（緑色の矢印が繊毛細胞、青色の矢印を表示、非繊毛細胞を示す）。

figure-protocol-2
図2走査電子マイクロ ex vivoでのC.トラコマティス感染したヒト卵管一日感染後（白い矢印マーク破裂インクルージョン）のコピー（SEM）。

figure-protocol-3
図3。セミ薄いセクションでは、Cと人間の卵管の感染後に典型的な細胞内封入体（白矢印）1Dを表示クラミジアエクスビボ 。

figure-protocol-4
図4：コントロール培地中で一日のインキュベーション後、非感染ヒト卵管の透過型電子顕微鏡（TEM）。

figure-protocol-5
図5 のex vivoでの透過型電子顕微鏡（TEM） クラミジアは、ヒトの卵管一日感染後（白矢印はクラミジア封入体にマークを付ける）を感染させた。

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図6。無謀な準備と検体の取り扱い（白い矢印マークは、上皮組織の破壊）を使用して破損して卵管上皮の走査電子顕微鏡（SEM）。

ディスカッション

感染組織への病原体によって誘発される損害の可視化は困難とマウスの実験手順にしばしば制限されています。我々 は 、C を分析するために人間の卵管にex vivoでの感染モデルを確立上部の雌の生殖器のクラミジア感染症。この方法を使用することによって、我々はC.を可視化することができましたマティス -一日後の感染内の人間卵管上皮に起因する損傷。携帯電話の腫れや溶解はC で観察された典型的な形態変化であったマティス -非感染コントロールの感染卵管はありません。 TEM分析は、再分化した小学校の体だけでなく、永続性を示している可能性があります拡大して網目状の本体と小さい介在物の大型介在物を示す、クラミジアは、感染した組織内に典型的な細胞内発育周期を実装することを明らかにした。しかし、単独で形態学的画像は、REPLを区別するのに十分ではありません減少し代謝を特徴としていicatingと永続的な感染症は、抗菌剤10に抵抗を増加させた。

感染した卵管の上皮の破壊は 、Cの破壊のいずれかによるものであるマティス -細胞内の発育サイクルや感染小学校団体のリリースや炎症性サイトカイン8のリリースが完了した後、感染した上皮細胞。病原体によって誘発される組織の損傷および Cに対する宿主によって誘導される免疫反応クラミジアは、上皮細胞機能の喪失、線維芽細胞のリモデリングおよび in vivo 8,11 で最後に卵管不妊につながる大きな要因であると考えられている。

このモデルの大きな制限の1つは、最初のCに二次的効果の分析を阻害する炎症性細胞の不在である卵管上皮のクラミジア感染症。しかし、このモデルはapです。異なる環境条件（例えば、酸素含有量）と急性Cの最初のホスト·免疫応答を調査するためにpropriate クラミジア感染症8,9。さらに計画ではC.に対する抗菌薬のテストのためのモデルを確立することです。全体の人間の卵管にクラミジアと2光子レーザー走査顕微鏡による卵管上皮で観察された別の発達段階の代謝状態を特徴づける。

開示事項

利害の衝突が宣言されません。

謝辞

この作品は、 "インターフェイスの炎症"エクセレンスのDFG-クラスター（RA-IF、RA-D）によってサポートされていました。我々は、クリスティンWischnatの優れた技術支援に感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-8​​02
FCS PAA A15-101
シクロヘキシミドシグマ - アルドリッチ
SPGのバッファさまざまな以下のレシピを参照してください。
モンティの固定さまざまな以下のレシピを参照してください。
カコジル酸ナトリウム緩衝液さまざまな以下のレシピを参照してください。
Richardsonの染色さまざまな以下のレシピを参照してください。

レシピ：

1。 SPGのバッファ

  1. 75グラムのショ糖を追加します。
  2. 2.47グラムリン酸二ナトリウムを追加します。
  3. 0.36グラムナトリウム、リン酸を追加します。
  4. 0.72グラムグルタミン酸を追加します。
  5. アクアdestが1 lに記入してください。
  6. 7.3にpHを調整します。

2。 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、7.35。

  1. 42.80グラムジメチルヒ酸ナトリウム塩を追加します。
  2. 68.46グラムのショ糖を追加します。
  3. アクアdestが1 lに記入してください。 0.2 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を取得します。
  4. アクアをdestで希釈した溶液を使用する前に。所望の濃度にし、必要に応じて7.35にpHを調整します。

3。モンティの固定

  1. 156ミリリットル0.12 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を追加します。 3.2アクアdestに25ミリリットル25パーセントタルジアルデヒドを追加します。
  2. 19ミリリットルを追加します。アクアdestに10％のパラホルムアルデヒド。
  3. アクアdestに3ミリリットル三パーセントCaCl 2を追加します。
  4. 7.35にpHを調整し、水をdestに記入してください。 312ミリリットル最終的な解決に。

4。リチャードソンの染色

  1. アクアdestの1％水溶液ホウ砂溶液と1％アズールIIで1％メチレンブルーの等しい部分を混在させること。

参考文献

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