細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング大腸菌合成遺伝子配列を用いて

Summary

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述大腸菌。

Abstract

表現型は、物理（蛋白質-蛋白質など ）と機能（ 例えば遺伝子遺伝子または遺伝的）相互作用^（GI）1一連の複雑によって決定されます。物理的な相互作用が細菌のタンパク質が複合体として関連付けられているかを示すことができますが、それらは必ずしも経路レベルの機能relationships1を明らかにしない。 2削除または不活性化された遺伝子をもつ二重変異株の増殖を測定し、対応する単一の変異体と比較されるGIの画面は、遺伝子座の間の上位性の依存性を照らすそれゆえ小説機能的関係^2を照会し、発見するための手段を提供することができる。大規模GIマップは酵母^3月7日のような真核生物のために報告したが、GIの情報は、細菌ゲノムの機能アノテーションを妨げる原核^8日のための疎のままされています。この目的のために、我々と他の人は、ハイスループット定量的な細菌性胃腸スクリーニング方法^{（9）（10）を}開発^しましたここでは、定量的なEを実行するために必要な主要な手順を提示全身的に生成し、コロニー配列形式の二重変異体の多数の適合度を測定するために自然な細菌接合と相同組換えを用いて大腸菌ゲノムスケールの⁹の合成遺伝子アレイ（eSGA）スクリーニング手順は、 簡単に述べると、ロボットを転送するために使用され、共役を介して、クロラムフェニコール（Cm） - 著しいF-レシピエント株 - （組換えの高周波）エンジニアリングHFRから変異アレルをマーク 'ドナー株'カナマイシン（菅）の規則正しい配列にします。一般的に、我々はに機能喪失型の非必須遺伝子欠失をもつ単一突然変異（ '慶應義塾'コレクション^{11 など} ）と必須遺伝子hypomorphic変異（還元タンパク質の発現、安定性、または活動^{9、12、13を}付与^する 、すなわち対立遺伝子）を使用非必須と必須遺伝子の機能アソシエーション、resを問い合わせるpectively。相同組換えによる共役とその後の遺伝子交換を媒介した後、得られた二重変異体は、両方の抗生物質を含有する固体培地上で選択されています。伸長した後、プレートをデジタル画像化されるとコロニーサイズを定量的に社内自動画像処理システム^14を用い^て採点されます。二重変異体の成長率はどちら有意に良好または⁹予想以上に悪化しているときにGISは明らかにされています。悪化（または負）GISは、多くの場合、同じ基本的なプロセス²に当たる代償経路からの遺伝子のペアにおける機能喪失型変異との間に生じる。ここでは、単一の遺伝子の損失は、単一の変異が生存可能であるように、バッファリングされます。しかし、両経路の損失は有害であると合成致死性または病気（ すなわち低成長）が返されます。逆に、緩和（または正）の相互作用と同じ経路またはタンパク質複合体²の遺伝子の間に発生する可能性がありますいずれかの遺伝子の欠失だけでは、多くの場合、追加摂動はさらに、活性を低下させるため、成長しないような経路または複合体の正常な機能を混乱させるのに十分である。全体的に、体系的にGIのネットワークを識別し、分析することは、他の手法では見逃さ経路レベルの情報が⁹推測することができ、そこから多数の遺伝子間の機能的関係の公平、グローバルマップを提供することができます。

Protocol

1。 ¹⁵遺伝子改変技術によりHFRカヴァッリドナー変異株を構築し^、16

eSGAドナー汚れを構築するための手順を以下に説明します。簡単に言えば、我々は対象とλを使う-赤は非必須遺伝子の欠失変異体（1.1項）またはHUPとして使用されている必須遺伝子hypomorphic変異ドナー株（セクション1.2）を作成し、PCRによって生成された増幅選択可能なDNAマーカーカセットの相同組換え¹⁶フラグメントを媒介GIのネットワークを定義するために 'クエリ'。

注：技術開発の過程で、我々は明確に定義されたHFRのドナー株（HFRカヴァッリ、HFRヘイズ、とHFR 3000）を使用して突然変異を結合するためのHFR媒介接合伝達を使用しての有効性を評価した。我々は、（i）効率的Yuらによって開拓コンビメソッドを使ってドナー突然変異体を作る能力を調べた。 ^{（2000）16、（ii）}の相対効率共役DNAの異なる染色体マーカーの転送、および（iii）クエリ遺伝子の位置とHFR転送軌跡、点の他に相対的な染色体の向きの効果。の我々は、λを発見- Red媒介相同組換えの効率がHFRヘイズまたはHfr3000よりHFRカヴァ....

Results

GIは、遺伝子間の機能的関係を明らかにします。同様に、同じ経路の遺伝子は類似のGIパターンを示し、GIプロファイルの類似性は表現型の一致を表すため、機能的に関連する遺伝子をGIプロファイルをクラスタリングすることで経路にグループ化できます。GIおよびGI相関ネットワークを物理的相互作用情報やゲノムコンテキスト(GC)関係などの他の関連データと統合することで、細菌の中核となる生物学的システム(およびシステムクロストーク)を定義する高次機能モジュールの組織化も明らかにすることができます。例えば、酵母^{4、6、7、26}と同様に、GIプロファイルも高度に相関する緩和相互作用を示す大腸菌遺伝子ペアは、物理的に関連するタンパク質をコードする傾向がある(例えば、複合体を形成する;図4a)または、一般的な生化学的経路で一貫して作用するもの(例:線形カスケードのコンポーネント)。代表的な例を図4bに示します。ここでは、機能的に冗長なIsc経路とSuf経路の成分が、必須のFe-S生合成プロセスに共同で関与し、広範な悪.......

Discussion

我々は、GIを問い合わせることによって経路レベルで細菌の遺伝子の機能を調べるためにロボットeSGAスクリーニングを使用するための段階的なプロトコルについて概説しました。このアプローチは、 大腸菌内の個々の遺伝子だけでなく、全体のシステム生物学を研究するために使用することができます大腸菌 。慎重に実験手順を実行すると、すべての適切なコントロールを含め、上記のように、そして厳格に分析し、独立して、GIのデータが新しい機能の発見を行う際にeSGAの成功のための重要な側面で検証する。 eSGA、 大腸菌にGIを研究するための概念的に類似した方法に加えて、 大腸菌は 、巨大大腸菌¹⁷と称され、しばしばこのようなプロテオーム²³または単独で表現型の¹³スクリーンなど他のアプローチでは見逃される新規機能的な関係を照らすために使用することができます。それにもかかわらず、任意のゲノムワイドなアプローチと同様に、制限は、例えば、他の細菌種に、eSGAまたは巨大大腸菌の適用に存在しない。これは部分的であることです特に標的突.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 抗生物質
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
Kanamycin		#KAN201
Ampicillin		# AMP201
2.ルリア・ベルタニ中
LB粉末	バイオショップ	#LBL405
寒天	バイオショップ	#AGR003
3.細菌株およびプラスミド
Hfr Cavalli株 λ<サブ>レッドシステム(JL238)	バブet al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
慶應義塾大学 大腸菌 F- recipient collection	National BioResource Project (NBRP) of Japan11
Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains	Open biosystems;バブet al.14
4.プライマー
pKD3ベースの脱塩定数プライマーF1			:5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1:5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
脱塩カスタムプライマーCm-R			:5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F:5'-GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
脱塩カスタムプライマー			F2 および R2: pKD3 配列に基づく 20 nt の定常領域と 45 nt のカスタム相同領域 F2 定領域: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 定領域: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTTCTC-3'S1 および S2: SPA-Cm カセットの増幅をプライミングするための 27 nt の定数領域と 45 nt のカスタム相同領域 S1 定領域: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F および KOCO-C: 20 nt プライマー 非必須遺伝子欠失部位または必須 遺伝子 SPA-tag 挿入部位<
>Taq DNAポリメラーゼ	Fermentas	# EP0281
10X PCRバッファー	Fermentas	#EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	#EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	#EP0281
Agarose	Bioshop	#AGA002
Loading染料	NEB	#B7021S
エチジウムブロマイド	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
ホウ酸		Sigma# T1503-1KG
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# B6768-500G
DNA ladder	NEB	#N3232L
6.DNA単離およびクリーンアップキット
ゲノムDNA単離および精製キット	Promega	#A1120
プラスミドMIDIキット	Qiagen	#12143
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	#28104<
サーマルサイクラー	BioRad、iCycler
アガロースゲル電気泳動	BioRad
エレクトロポレーター	Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm エレクトロポレーションキュベット	Bio-Rad
42 °CウォーターバスシェーカーInnova	3100
ックマンコールターTJ-25遠心分離機	ベックマンコールター32
度;Cシェーカー	New Brunswick Scientific, USA
32 °Cプレートインキュベーター	フィッシャーサイエンティフィック
RoToR-HDA 卓上型ロボット	シンガーインスツルメンツ
96、384、1,536ピン密度パッド	シンガーインスツルメンツ
96または384ロングピン	シンガーインスツルメンツ
8.イメージング機器
カメラスタンド	カイザー
デジタルカメラ、10メガピクセル	任意のベンダー
ライトボックス、Testrite 16 "x 24"ユニット	Testrite
9。パッドまたはプレート リサイクル
10% 漂白剤	任意のベンダー
70% エタノール	任意のベンダー
滅菌蒸留水	任意のベンダー
フローフード	任意のベンダー
紫外線ランプ	任意のベンダー
10.ラボウェア
50 ml ポリプロピレンチューブ	任意のベンダー
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	任意のベンダー
250 ml 円錐形高射砲	VWR	# 29140-045
15 ml 滅菌培養チューブ	Thermo Scientific	# 366052
極低温バイアル	VWR	# 479-3221
長方形プレート	Singer Instruments
96ウェルおよび384ウェルマイクロタイタープレート	Singer Instruments	Nunc
マルチウェルシール用プレートローラー	Sigma	#R1275
プレート	ABgene	# AB-0580
接着プレートシール	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
°C冷凍庫	任意のベンダー