のタンパク質複合体の同定大腸菌タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Summary

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明大腸菌。

Abstract

ほとんどの細胞プロセスを高分子アセンブリによって媒介されているので、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）および多タンパク質複合体のサブユニット組成の同定を体系的に同定は、遺伝子の機能への洞察を提供し、生物学的システム^1,2の理解を高めることができます。物理的な相互作用は、質量分析法（APMS）と組み合わせて染色体タグ融合タンパク質のアフィニティー精製に基づいて近い生理的条件下で内因性のタンパク質複合体の高い信頼vialargeスケールの単離および特性をマッピングすることができます。このアプローチは正常酵母、ハエ、虫、哺乳類細胞、細菌^1月6日を含め進化的に多様な生物に適用されています。特に、我々はGEを使用して、培養したグラム陰性大腸菌からアフィニティー精製、天然のタンパク質複合体のためのカルボキシ末端シーケンシャルペプチドアフィニティー（SPA）をデュアルタギングシステムを生成した基礎生物学と生物^1、2、7の保存プロセスのゲノムワイドな研究に適していnetically-扱いやすいホスト実験室株。当社SPA-タグシステムは、酵母^8,9のために最初に開発されたタンデムアフィニティー精製法に類似していて、非常に特異的なタバコエッチウイルス （TEV）プロテアーゼと3つのコピーの切断部位が続くカルモジュリン結合ペプチド（CBP）から構成されていFLAGエピトープ（3X FLAG）の、親和性濃縮の2連続ラウンドを可能にする。カセットの増幅後、SPA-タグおよび選択可能なマーカーをコードする配列特異線形PCR産物が統合されており、一時的に非常に効率的な異種バクテリオファージラムダ組換え系^10の発現^が誘導さDY330背景にカルボキシ末端融合としてフレームで表現されます。カルモジュリンと抗FLAGアフィニティービーズを使用して、後続のデュアルステップ精製が高度に選択が可能大規模な文化からでも低濃度のタンパク質複合体と効率的な回収。タンデム質量分析を高感度（低ナノグラム検出限界）で安定して共同精製タンパク質を同定するために使用されます。

ここでは、 大腸菌由来の可溶性タンパク質複合体の精製と質量分析ベースの分析、我々は一般的に体系的タンパク質のタグ付けに使用する詳細なステップバイステップの手順を説明します大腸菌 、スケールアップと潜在的にコンビに従順である特定の日和見病原体を含む他の細菌種に合わせて調整することができます。結果の物理的相互作用は、しばしば小説序のリンクを示唆して興味深い予想外のコンポーネントと接続を明らかにすることができます。予測はBI内多タンパク質複合体のグローバルな分子組織の解明を容易にすることができますこのような遺伝的（遺伝子遺伝子）の相互作用とゲノム·コンテキスト（GC）などの代替分子会合データとPPIデータの統合ological経路。 大腸菌に対して生成されたネットワーク大腸菌は、機能アノテーションは現在欠けているために他の微生物のオーソログ遺伝子産物の機能アーキテクチャへの洞察を得るために使用することができます。

Protocol

1。 大腸菌における遺伝子固有のSPA-タギングの構築大腸菌 DY330ひずみ

1. SPA-タグのDNA配列及びカナマイシン抗生物質耐性マーカーカセット（菅^R）が包含プラスミドpJL148は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅⁷のテンプレートとして使用されています。 27 BP（5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 '）タグ特異的なフォワードプライマーとフレーム内の標的遺伝子の終止コドンのすぐ上流に位置する45 ntの遺伝子特異的なフォワードプライマー、および45 ntの遺伝子特異的リバースプライマーは、すぐに位置して94：27 BP（5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 '）タグ特異的リバースプライマーを用いたフレーム内の標的遺伝子の終止コドンの下流には、以下のPCRサイクリング条件を用いpJL148からSPAタグと菅^Rのカセットを増幅するために使用される5分間℃、1分間、68で1分間、55°C、10分間68℃に続いて2分10秒の場合はC、94°Cの30サイクル。これらの増幅された配列は、サーブ異所的に導入されたλ-赤相同組換え用機械の基板（下記参照）。
2. PCR産物は、エレクトロポレーションを妨げる可能性が塩を除去するためにQIAQUICK PCR精製キットを用いて精製する。精製したPCR産物は、その....

Results

対数相培養物から内在性レベルで発現するタグ付きベイトタンパク質を親和性精製した後、サンプルを銀染色ゲル上で実行し、単離された安定複合体の個々のポリペプチド成分を可視化しました。また、アフィニティー精製されたタンパク質サンプルの2番目の部分をゲルフリータンデム質量分析(LCMS)にかけ、対応するポリペプチド配列を同定しました。このAPMS手順の有効性は、大腸菌から親和性精製されたRNAポリメラーゼ(RNAP)およびSufBCD鉄-硫黄(Fe-S)タンパク質複合体の成分の代表的なSDS-PAGE分析で示されています(図1CおよびD)。SPAタグ付きRNAP σ⁷⁰(RpoD)とYacL(機能不明のタンパク質)は、α(RpoA)、β(RpoB)、β'(RpoC)サブユニットなどのコアRNAP酵素と特異的に共精製され、RNAPリサイクル因子(HepA)とともに共精製されます。タグ付きRpoDとは対照的に、YacLは必須の転写終結/抗終結因子(NusG)に追加で結合しており、転写における特殊な機能が示唆されています。また、RNAP ωサブユニットであるRp.......

Discussion

ここで説明するSPAベースAPMSアプローチの重要な側面は、タギングがそれによって正常な遺伝子調節を確保し、自然な染色コンテキスト内で実行される維持（ すなわち 。ネイティブ餌プロモーターが保持され、それ故に発現レベルが乱されていない）と安定的に結合したネイティブであるということですタンパク質複合体は、近内在性レベルで回収される。オペロンの極性の問題は、選択マーカーで外向き志向のプロモーターを含むことによって避けられる。このSPA-タギングの手法は、サブユニットは、細菌の細胞あたりわずか数分子にまで表現されている場合であっても、膜関連アセンブリを含む、ほぼ均一に低濃度の複合体の成分を浄化するのに十分な効果があります。全体的に、このプロトコルは、 大腸菌でタグ付けされた可溶性タンパク質の大規模セットを精製するために容易にスケールアップすることができます大腸菌又は原則としてコンビ経由タギングが可能な他の細菌種、またはtransformaその保有は当然高いもの標的遺伝子ノックアウト¹³のひずみライブラリを構築するために、例えば、使用されているアシネトバクター、細菌の遺.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 抗生物質
>Kanamycin	Bioshop	#KAN201
アンピシリン	Bioshop	#AMP201
2.Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
酵母エキス	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3.細菌株とプラスミド
DY330		Yu et al.(2000)10
pJL148		ゼグーフet al.(2004)7
4.PCRおよび電気泳動試薬
>Taq DNAポリメラーゼ	Fermentas	# EP0281
10 X PCRバッファー	Fermentas	#EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	#EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	#EP0281
Agarose	Bioshop	#AGA002
Loading染料	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
5.プラスミド単離およびクリーンアップキット
プラスミドMIDIキット	Qiagen	#12143
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	#28104
6.PCRおよび形質転換装置
サーマルサイクラー	BioRad	iCycler
アガロースゲル電気泳動	BioRad
エレクトロポレーター	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm エレクトロポレーションキュベット	Bio-Rad
42 °CウォーターバスシェーカーInnova		3100
ックマンコールターTJ-25遠心分離機	ベックマンコール	ターTS-5.1-500
32 °C シェーカー	ニューブランズウィック サイエンティフィック アメリカ
32 °C 大型シェーカー	ニューブランズウィック サイエンティフィック、米国
32 >Cプレートインキュベーター	Fisher Scientific
7.電気泳動およびウェスタンブロッティング
アクリルアミドモノマー、N,N'-メチレンビスアクリルアミド	Bio-Rad	#161-0125
過硫酸アンモニウム	Bioshop	# AMP001
n-ブタノール	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 ろ紙	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horserad peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stainedタンパク質分子量標準	Bio-Rad	#161-0363
化学発光試薬	PIERCE	#1856136
オートラジオグラフィーフィルム	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw 吸い取り紙	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
>Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9.Affinity Purification 試薬および装置
0.8 x 4 cm Bio-Rad ポリプロピレンカラム	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
トリトン X-100 Σ		Σ #T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Σ	#E3889
LabQuake シェーカー	サーモリン	#59558
10.銀染色試薬
メタノール	バイオショップ	#MET302
酢酸	バイオショップ	t#ACE222
チオ硫酸ナトリウム	Sigma	#S-7143
硝酸銀	ッシャーサイエンティフィ	#S181-100
ホルムアルデヒド	バイオショップ	#FOR201
炭酸ナトリウム	Bioshop	#SOC512
11.蛋白質の同一証明のための試薬そして装置
Trypsin Gold、質量分析の等級	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
アセトニトリル	Sigma	#A998-4
Formic酸性	シグマ	#F0507
HPLCグレードの水	Sigma	#95304
ヨードアセトアミド	Sigma	#16125
ミリポア ジップチップ	ミリポア	#ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 樹脂	Phenomenex
Proxeon nano HPLC ポンプ	サーモフィッシャーサイエンティフィック
LTQ Orbitrap Velos 質量分析計		サーモフィッシャーサイエンティフィ
12.実験器具
4リットル 円錐形フラスコ	VWR	#89000-372
50 ml ポリプロピレン製ファルコンチューブ	任意のベンダー
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	任意のベンダー
250 ml 円錐形フラック	VWR	#29140-045
15 ml 滅菌培養チューブ	Thermo Scientific	#366052
極低温バイアル	VWR	#479-3221-80
°C 冷凍庫	Fisher Scientific	#13-990-14
スピード真空システム	Thermo Scientific
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g 酵母抽出物 2% Glycerol 50 ml カリウム塩ストックsolution 2.カリウム塩原液 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3.超音波処理バッファー 20 mM Tris-HCl（pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10%グリセロール 使用前にプロテアーゼ阻害剤（PI)と0.1-0.5 mM TCEP 4を加えてください。AFCバッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% 界面活性剤 使用前にPIと0.1-0.5 mM TCEP 5.TEV切断バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 界面活性剤 使用前にPIと0.1-0.5 mM TCEP 6.カルモジュリン結合バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 界面活性剤 使用前に、PIと0.1-0.5 mM TCEP 7.カルモジュリン洗浄バッファー 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8.カルモジュリン溶出バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9.現像液(1L) 37%ホルムアルデヒド 30 g炭酸ナトリウム 1000ml蒸留水 10。消化バッファー 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11.0.1%ギ酸 > <12 jove_step">12.洗浄液 0.1%ギ酸2O>