のタンパク質複合体の同定大腸菌タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Summary

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明大腸菌。

Abstract

ほとんどの細胞プロセスを高分子アセンブリによって媒介されているので、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）および多タンパク質複合体のサブユニット組成の同定を体系的に同定は、遺伝子の機能への洞察を提供し、生物学的システム^1,2の理解を高めることができます。物理的な相互作用は、質量分析法（APMS）と組み合わせて染色体タグ融合タンパク質のアフィニティー精製に基づいて近い生理的条件下で内因性のタンパク質複合体の高い信頼vialargeスケールの単離および特性をマッピングすることができます。このアプローチは正常酵母、ハエ、虫、哺乳類細胞、細菌^1月6日を含め進化的に多様な生物に適用されています。特に、我々はGEを使用して、培養したグラム陰性大腸菌からアフィニティー精製、天然のタンパク質複合体のためのカルボキシ末端シーケンシャルペプチドアフィニティー（SPA）をデュアルタギングシステムを生成した基礎生物学と生物^1、2、7の保存プロセスのゲノムワイドな研究に適していnetically-扱いやすいホスト実験室株。当社SPA-タグシステムは、酵母^8,9のために最初に開発されたタンデムアフィニティー精製法に類似していて、非常に特異的なタバコエッチウイルス （TEV）プロテアーゼと3つのコピーの切断部位が続くカルモジュリン結合ペプチド（CBP）から構成されていFLAGエピトープ（3X FLAG）の、親和性濃縮の2連続ラウンドを可能にする。カセットの増幅後、SPA-タグおよび選択可能なマーカーをコードする配列特異線形PCR産物が統合されており、一時的に非常に効率的な異種バクテリオファージラムダ組換え系^10の発現^が誘導さDY330背景にカルボキシ末端融合としてフレームで表現されます。カルモジュリンと抗FLAGアフィニティービーズを使用して、後続のデュアルステップ精製が高度に選択が可能大規模な文化からでも低濃度のタンパク質複合体と効率的な回収。タンデム質量分析を高感度（低ナノグラム検出限界）で安定して共同精製タンパク質を同定するために使用されます。

ここでは、 大腸菌由来の可溶性タンパク質複合体の精製と質量分析ベースの分析、我々は一般的に体系的タンパク質のタグ付けに使用する詳細なステップバイステップの手順を説明します大腸菌 、スケールアップと潜在的にコンビに従順である特定の日和見病原体を含む他の細菌種に合わせて調整することができます。結果の物理的相互作用は、しばしば小説序のリンクを示唆して興味深い予想外のコンポーネントと接続を明らかにすることができます。予測はBI内多タンパク質複合体のグローバルな分子組織の解明を容易にすることができますこのような遺伝的（遺伝子遺伝子）の相互作用とゲノム·コンテキスト（GC）などの代替分子会合データとPPIデータの統合ological経路。 大腸菌に対して生成されたネットワーク大腸菌は、機能アノテーションは現在欠けているために他の微生物のオーソログ遺伝子産物の機能アーキテクチャへの洞察を得るために使用することができます。

Protocol

1。 大腸菌における遺伝子固有のSPA-タギングの構築大腸菌 DY330ひずみ

1. SPA-タグのDNA配列及びカナマイシン抗生物質耐性マーカーカセット（菅^R）が包含プラスミドpJL148は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅⁷のテンプレートとして使用されています。 27 BP（5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 '）タグ特異的なフォワードプライマーとフレーム内の標的遺伝子の終止コドンのすぐ上流に位置する45 ntの遺伝子特異的なフォワードプライマー、および45 ntの遺伝子特異的リバースプライマーは、すぐに位置して94：27 BP（5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 '）タグ特異的リバースプライマーを用いたフレーム内の標的遺伝子の終止コドンの下流には、以下のPCRサイクリング条件を用いpJL148からSPAタグと菅^Rのカセットを増幅するために使用される5分間℃、1分間、68で1分間、55°C、10分間68℃に続いて2分10秒の場合はC、94°Cの30サイクル。これらの増幅された配列は、サーブ異所的に導入されたλ-赤相同組換え用機械の基板（下記参照）。
2. PCR産物は、エレクトロポレーションを妨げる可能性が塩を除去するためにQIAQUICK PCR精製キットを用いて精製する。精製したPCR産物は、その後、λ-赤組換え機構が^10を発現しているDY330株における特定の遺伝子の3 '末端（ネイティブ終止コドンのすぐ上流側）に統合することをターゲットにしています。
3. DY330λ - レッド発現株を180 rpmで振とうすることにより、32℃で2ミリリットルルリア - ベルターニ（LB）培地中で一晩増殖されています。一晩培養した培養液の1ミリリットルは続いて500ミリリットルの三角フラスコに70 mlの新鮮なLB培地に接種する。接種は、OD _600が約0.8に達するまで、180 rpmで振とうすることにより、32℃で栽培されています。
4. 文化は、穏やかに振とうすることにより細胞を42℃の水浴中でフラスコをインキュベートすることによって誘導される新鮮な250ミリリットルの三角フラスコ、°Cに転送されます15分間180回転。すぐに誘導した後、フラスコを振とうしながら、少なくとも30分間氷水スラリー浴でインキュベートする。
5. 氷のように冷たい文化は直ちに予冷50mlポリプロピレンチューブに移し、4℃で6分間3993 xgで遠心分離にかけ℃です。細胞ペレットを50mlの氷冷滅菌水に再懸濁し、4℃で6分間3993 xgで再び遠心分離する細胞ペレットを冷水1mlに再懸濁し、1.5ミリリットルEffendorfチューブに移し、4℃で20秒間、最大速度で遠心分離する氷冷水で2または3回の洗浄工程後、細胞ペレットを電気コンピテントセルで、その結果、氷冷滅菌水700μlにようやく再懸濁する。
6. エレクトロポレーションにより、精製されたアンプリコンの1μlをエレクトロコンピテントセル40μlの中に導入される。 2.5kVで、パルスで25μF：細胞は、次の設定を使用してバイオ·ラッドGenePulser IIに​​エレクトロポアール200Ωのコントローラ。相同組換えと統合した後、正常染色体へのタグ/カセットを換え形質転換体は、菅（ 図1A）に対する耐性に基づいて選択されます。複数の形質転換体はウェスタンSPA-タグのFLAGエピトープに対する選択的な抗FLAG M2抗体によるSPA-タグ融合タンパク質の正しい世代（ すなわち、正信号）を確認するためにブロッティング用に選択されます。
7. 確認されたカルボキシ末端のSPA-タグ融合株は、SPA精製プロトコルを使用して採取された細胞から可溶性タンパク質複合体を単離するために、大規模で培養する。アフィニティータグ精製操作に必要な手順の概要を図1Bに示されている。

2。培養すると超音波処理

1. SPA-タグE.100μlを接種する50ミリリットルTerrificブロス（TB）に大腸菌グリセロールストックは、液体培地は、25μg/ mlのOの50μlを補充250ミリリットルの三角フラスコ中のf菅ソリューションを提供します。 32℃で一晩培養する
   注：ひずみDY330の温度誘導性λ赤カセットは温度感受性リプレッサー¹⁰の制御下にあるので、SPA-タグ大腸菌株は、32℃で栽培されている
2. 4リットルのフラスコに菅の25μg/ mlのを補足した990ミリリットル新鮮結核に一晩培養液10ミリリットルを転送します。 OD _600が約2〜3に達するまで培養は、32℃で一定には5〜6時間、250rpmで振盪しながら成長させる。
3. 1リットルEを転送大腸菌は、SPA-タグ·文化遠心ボトルをきれいにし、15分間ベックマン℃·J6-HCの遠心分離機@ 3993×gで4℃で細胞を回転させる。
4. 上清を遠心分離ボトルから削除されます。 大腸菌を懸濁する超音波処理緩衝液25mlを大腸菌細胞ペレット。すべての回で、氷上で遠心ボトルを維持することを確認します。
5. 再懸濁ペレットです50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブに移し、液体窒素を用いて凍結した。凍結細胞は-80℃で長期使用するために保存されます。
6. 超音波処理に先立って、氷の上にペレットを保つことによって完全に凍結細胞を解凍します。解凍されたサンプルは、超音波処理のために氷上に置い滅菌ステンレス製のカップに移しています。プローブを試料に浸漬し、3分間超音波処理する。追加の2分間は過熱から試料を冷却する。
7. 超音波処理した細胞溶解液をあらかじめ冷却滅菌遠心管に移し、そして二回15分間、JA-17ローター@ 35267×gで（16,000 rpm）を用いてベックマン遠心機で、4℃で遠心分離にかけられる。
   注：私達は膜タンパク質である画分にわからないので、膜タンパク質の精製の ​​場合には、超音波処理した細胞溶解液を15分間遠心分離し、一度だけ、それはペレット中または上清画分のいずれかです。だからmemの過剰損失を避けるためにブレーンタンパク質は、我々は、高速遠心分離で15分間細胞をスピンさせ、上清を、その後1％の洗剤が膜タンパク質を可溶化するために使用されている場所（以下の手順を参照）精製のために処理されます。
8. 遠心チューブから上清を慎重に50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブに移し、液体窒素を用いて凍結されています。超音波処理した凍結細胞抽出物は、将来の使用のために-80℃で6ヶ月の最大期間保存されています。

3。親和性精製

1. 使用前に、抗FLAG M2ビーズ100μlのAFCバッファー（30mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、0.1％の洗剤、および0.1から0.5 mMのTCEP [トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィンの10倍量で洗浄する-洗剤なし塩酸]）と還元剤TCEP（トリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン）。
2. 凍結、超音波処理した細胞抽出物を冷たい水にチューブを配置することにより、解凍する。解凍した細胞抽出物をベンゾを3μlとインキュベートされる4℃で30分間naseヌクレアーゼこの混合物に、非イオン性界面活性剤トリトンX-100（界面活性剤の最終濃度が0.1％であるべきである）と抗FLAG M2アガロースビーズを200μlの懸濁液を追加します。
   注：すべての可溶性タンパク質の精製の ​​ために、0.1％トリトンX-100などのC12E8（オクタエチレングリコールドデシルエーテル）などの膜タンパク質は、別の軽度の非イオン性界面活性剤を精製するために、DDM（非特異的吸着を最小限に抑えるために使用されn-ドデシル-β-D-マルトシド）とマルトースネオペンチルグリコール（MNG）の可溶化を高めるために、1％の界面活性剤の濃度で使用することができます。別の洗剤は、膜タンパク質の可溶化効率を変化しているので、複数の洗剤を使用して独立したタンパク質の精製を行うことを推奨します。
3. コンテンツは℃LabQuake振とう機を用いて4℃で3時間真空管を回転させることにより穏やかに混合しています。回転の3時間後、チューブを6分間1700 xgで遠心分離する。上清はその後rです緩いビーズペレットを乱さずに、できるだけ、慎重にemoved。
4. ペレットは、残りの上清中に再懸濁させ、その後0.8×4センチメートルBio-Rad社製ポリプロピレンプレップカラムに転送されます。溶出液は、重力流によって排水できるようにするために、カラムの底コンセントプラグを削除することを確認します。 TEV切断工程でカラムを5回洗浄します。
5. 洗浄された溶出液を排出した後、カラムの底部出口が閉鎖されている。同じ列に、切断は、カラムにTEVプロテアーゼおよび1X AFCのバッファーを400μlの約5から10μL（50単位）を追加することによって行われます。キャップ付きの列の上部を閉じることを確認します。ビーズを含む列がLabQuake振とう機を用いて4℃で一晩一晩静かに回転される。
6. 列の下部に上部とコンセントプラグのキャップを外し、10により洗浄されるカルモジュリンセファロースビーズを200μlの懸濁液を含有する新鮮な列にTEV切断後に回収した溶出液を排出カルモジュリン結合バッファーのボリューム。
7. と塔の上下両方がしっかりと固定され、列の内容は℃のLabQuake振とう機を用いて4℃で3時間回転させることにより穏やかに混合する。
8. 回転の3時間後、溶出液をカラムの上部のキャップと底栓を除去することによって排出される。列は、カルモジュリンの洗浄バッファー400μLで1ジェントな洗浄が続く1Xカルモジュリン結合バッファー200μlで4回洗浄する。
9. 結合したタンパク質を1Xカルモジュリン溶出緩衝液を用いて新鮮なエッペンドルフチュー​​ブに50μlの4画分に溶出されます。溶出画分を等量の2つのきれいなエッペンドルフチュー​​ブに分配されます。両方の管が続いて高速真空を使用して乾燥させる。
10. 他の前の質量分析を使用し、-80℃に保存されているときに、もう1つの管からの溶出液を乾燥させ、銀染色ゲルを実行するために使用されます。

4。銀染色

1. 銀staini用NG、3X SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、サンプルバッファの半分のボリュームは、乾燥した溶出液の50μlに追加されます。 5分間煮沸した後、試料をSDSポリアクリルアミドゲル上にロードされます。
2. ゲルの実行が終了した後、それを慎重に固定液に入れられ（50％メタノールと10％酢酸）と20分間ロータリーシェーカーで穏やかに攪拌されています。その後、ゲルを10分間、20％エタノールでリンスする。
3. 固定されたゲルは低い均一な背景を確実にするために10分間再蒸留水500mlで2回徹底的に洗浄する。
4. その後、ゲルを20秒間、蒸留水で2回の洗浄工程に続いて1分間、500mlのチオ硫酸ナトリウムで穏やかに攪拌されています。
5. 水を捨て、ゲルを30分間0.1％硝酸銀の200ミリリットルでインキュベートする。その時間が経過した後、硝酸銀が削除され、ゲルは、過剰の硝酸銀を削除するには、20秒間、蒸留水で洗浄する。
6. ゲルがついに75mlに撹拌手である現像液の。所望の強度が達成されると、現像液は廃棄され、酢酸80mlを加えて反応を停止しています。ゲルのバンドの適切な可視化のための20分間の最小値に対して酢酸でゲルをインキュベートすることを確認します。

5。質量分析のためのタンパク質分解とサンプルの調製

1. 乾燥した試料に、消化緩衝液50μlおよび100mM TCEP-塩酸（トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン-塩酸）0.9μlを添加し、室温で45分間混合物をインキュベート 還元工程のために。次に、500mMのヨードアセトアミドを1μl添加し、サンプルのアルキル化を可能にするために別の40分間、暗所でインキュベートする。
2. インキュベーションの第二ラウンド後、この混合物に固定化トリプシンの1μgを追加し、5時間または室温で一晩37℃でインキュベートどちらか。酢酸1μlを加えて反応を停止することを確認します。
3. プリウェットMillipo湿潤および平衡溶液10μlを吸引による再ジップヒントピペットチップ。無駄にするソリューションを免ずる。その後、洗浄溶液10μLを吸引し、無駄にするソリューションを免ずる。二回、この手順を繰り返します。
4. 先端までのペプチド混合物の効率的な結合は、ピペットは、ペプチド混合物を20回混ぜる。先端に付着したペプチド混合物を吸引し、洗浄溶液を分注することにより洗い流される。先端までのペプチド混合物の効率的な結合のために二度、この手順を繰り返します。
5. 結合したペプチドを含む先端で、湿潤および平衡溶液10μlを吸引し、クリーンなエッペンドルフチュー​​ブに分注する。この工程を2回繰り返します。使用する°Cの前速度、真空中で溶出した試料を乾燥させた後、試料を質量分析によって直ちに解析することができ、または-80℃で保存。

6。 LTQオービトラップVelos質量分析計によるタンパク質同定

木曜日隔離された複合体の電子ポリペプチド成分はのLTQオービトラップVelosハイブリッドタンデム質量分析計を使用して識別されます。オービトラップは高速Velosイオントラップしながら、コントロール精製で検出無関係な非特異的なバックグラウンド汚染物のMS / MSサンプリングを最小限に抑えることが非常に優れた解像力（> 60,000全幅半値か、FWHM）と質量精度（<2 ppm）を持ってコンポーネントは、電子移動解離と衝突誘起解離の両方のモードを使用して、低濃度のペプチドを検出およびフラグメントすることができます。結果としてMS / MSスペクトルの間で高い信頼マッチはリファレンスEにマップされSEQUESTとSTATQUEST ¹¹のような確率アルゴリズムの実行中は、評価した各照合シーケンスなどのデータベース検索アルゴリズムを使用して大腸菌タンパク質配列。合計スペクトル番号、陰性コントロール（ すなわち 。モック）精製で検出されたペプチド配列の一意性と共通のバックグラウンド汚染物質をfalse-DISロー経験を達成するために考えられているcovery率。次の手順は、タンパク質の同定のために実行されています：

1. マイクロカラムが3μmルナ〜C ₁₈樹脂の約10 cmの満員とオービトラップ器に沿って配置されProxeonナノエレクトロスプレーイオン源にインタフェースされています。
2. ProxeonナノフローバイナリHPLCポンプは、ペプチド分離の間に約300 nlの分^-1の安定した先端流量を提供する目的で使用されます。
3. ペプチド溶出を達成するために、有機緩衝勾配は、サンプルの複雑さに応じて設定されています。たとえば、次のような勾配は、通常、 大腸菌用に設定されている大腸菌 SPA のサンプル：溶媒Bは1分間100パーセントで開催された次の4分間、100％に、38分で24％に、1分間に2〜6％から増加しているが、その後、1分で2％に減少そして最終的には15分間2％に保持します。溶媒Bが5％、HPLCグラジエント水および0.1％ギACIと95％ACNを有しているが、0.1％のギ酸と95％HPLCの勾配の水と5％ACNを持って移動相溶媒D。針の先端で流量を60分間300 nlの分^-1に設定されます。
4. 質量分析計サイクルが60,000の解像度でフル1質量走査を介して実行すると、10併用タンデムフラグメント化質量スキャンが最も強烈な前駆体イオンのために収集されています。動的除外、モノアイソトピック質量の選択、およびリアルタイムデータ依存取得装置機能が有効になっています。
5. スペクトルは、例えば大腸菌のデータベースに対するSEQUESTなどのデータベース検索アルゴリズムを用いて検索されます大腸菌のタンパク質配列し、その結果を統計的に低い偽の発見率を確保するためにそのようなSTAQUEST ¹¹として確率アルゴリズムを使用してフィルタリングされます。マッチが理論的なペプチド質量に比べて10 ppmの質量誤差を示すさらなる検討の対象から除かれている間のみ、高い信頼性（99％確率）候補が、選択されています。

Results

対数相培養物から内在性レベルで発現するタグ付きベイトタンパク質を親和性精製した後、サンプルを銀染色ゲル上で実行し、単離された安定複合体の個々のポリペプチド成分を可視化しました。また、アフィニティー精製されたタンパク質サンプルの2番目の部分をゲルフリータンデム質量分析(LCMS)にかけ、対応するポリペプチド配列を同定しました。このAPMS手順の有効性は、大腸菌から親和性精製されたRNAポリメラーゼ(RNAP)およびSufBCD鉄-硫黄(Fe-S)タンパク質複合体の成分の代表的なSDS-PAGE分析で示されています(図1CおよびD)。SPAタグ付きRNAP σ⁷⁰(RpoD)とYacL(機能不明のタンパク質)は、α(RpoA)、β(RpoB)、β'(RpoC)サブユニットなどのコアRNAP酵素と特異的に共精製され、RNAPリサイクル因子(HepA)とともに共精製されます。タグ付きRpoDとは対照的に、YacLは必須の転写終結/抗終結因子(NusG)に追加で結合しており、転写における特殊な機能が示唆されています。また、RNAP ωサブユニットであるRp...

Discussion

ここで説明するSPAベースAPMSアプローチの重要な側面は、タギングがそれによって正常な遺伝子調節を確保し、自然な染色コンテキスト内で実行される維持（ すなわち 。ネイティブ餌プロモーターが保持され、それ故に発現レベルが乱されていない）と安定的に結合したネイティブであるということですタンパク質複合体は、近内在性レベルで回収される。オペロンの極性の問題は、選択マーカーで外向き志向のプロモーターを含むことによって避けられる。このSPA-タギングの手法は、サブユニットは、細菌の細胞あたりわずか数分子にまで表現されている場合であっても、膜関連アセンブリを含む、ほぼ均一に低濃度の複合体の成分を浄化するのに十分な効果があります。全体的に、このプロトコルは、 大腸菌でタグ付けされた可溶性タンパク質の大規模セットを精製するために容易にスケールアップすることができます大腸菌又は原則としてコンビ経由タギングが可能な他の細菌種、またはtransformaその保有は当然高いもの標的遺伝子ノックアウト¹³のひずみライブラリを構築するために、例えば、使用されているアシネトバクター、細菌の遺...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 抗生物質
>Kanamycin	Bioshop	#KAN201
アンピシリン	Bioshop	#AMP201
2.Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
酵母エキス	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3.細菌株とプラスミド
DY330		Yu et al.(2000)10
pJL148		ゼグーフet al.(2004)7
4.PCRおよび電気泳動試薬
>Taq DNAポリメラーゼ	Fermentas	# EP0281
10 X PCRバッファー	Fermentas	#EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	#EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	#EP0281
Agarose	Bioshop	#AGA002
Loading染料	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
5.プラスミド単離およびクリーンアップキット
プラスミドMIDIキット	Qiagen	#12143
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	#28104
6.PCRおよび形質転換装置
サーマルサイクラー	BioRad	iCycler
アガロースゲル電気泳動	BioRad
エレクトロポレーター	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm エレクトロポレーションキュベット	Bio-Rad
42 °CウォーターバスシェーカーInnova		3100
ックマンコールターTJ-25遠心分離機	ベックマンコール	ターTS-5.1-500
32 °C シェーカー	ニューブランズウィック サイエンティフィック アメリカ
32 °C 大型シェーカー	ニューブランズウィック サイエンティフィック、米国
32 >Cプレートインキュベーター	Fisher Scientific
7.電気泳動およびウェスタンブロッティング
アクリルアミドモノマー、N,N'-メチレンビスアクリルアミド	Bio-Rad	#161-0125
過硫酸アンモニウム	Bioshop	# AMP001
n-ブタノール	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 ろ紙	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horserad peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stainedタンパク質分子量標準	Bio-Rad	#161-0363
化学発光試薬	PIERCE	#1856136
オートラジオグラフィーフィルム	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw 吸い取り紙	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
>Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9.Affinity Purification 試薬および装置
0.8 x 4 cm Bio-Rad ポリプロピレンカラム	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
トリトン X-100 Σ		Σ #T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Σ	#E3889
LabQuake シェーカー	サーモリン	#59558
10.銀染色試薬
メタノール	バイオショップ	#MET302
酢酸	バイオショップ	t#ACE222
チオ硫酸ナトリウム	Sigma	#S-7143
硝酸銀	ッシャーサイエンティフィ	#S181-100
ホルムアルデヒド	バイオショップ	#FOR201
炭酸ナトリウム	Bioshop	#SOC512
11.蛋白質の同一証明のための試薬そして装置
Trypsin Gold、質量分析の等級	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
アセトニトリル	Sigma	#A998-4
Formic酸性	シグマ	#F0507
HPLCグレードの水	Sigma	#95304
ヨードアセトアミド	Sigma	#16125
ミリポア ジップチップ	ミリポア	#ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 樹脂	Phenomenex
Proxeon nano HPLC ポンプ	サーモフィッシャーサイエンティフィック
LTQ Orbitrap Velos 質量分析計		サーモフィッシャーサイエンティフィ
12.実験器具
4リットル 円錐形フラスコ	VWR	#89000-372
50 ml ポリプロピレン製ファルコンチューブ	任意のベンダー
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	任意のベンダー
250 ml 円錐形フラック	VWR	#29140-045
15 ml 滅菌培養チューブ	Thermo Scientific	#366052
極低温バイアル	VWR	#479-3221-80
°C 冷凍庫	Fisher Scientific	#13-990-14
スピード真空システム	Thermo Scientific
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g 酵母抽出物 2% Glycerol 50 ml カリウム塩ストックsolution 2.カリウム塩原液 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3.超音波処理バッファー 20 mM Tris-HCl（pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10%グリセロール 使用前にプロテアーゼ阻害剤（PI)と0.1-0.5 mM TCEP 4を加えてください。AFCバッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% 界面活性剤 使用前にPIと0.1-0.5 mM TCEP 5.TEV切断バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 界面活性剤 使用前にPIと0.1-0.5 mM TCEP 6.カルモジュリン結合バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 界面活性剤 使用前に、PIと0.1-0.5 mM TCEP 7.カルモジュリン洗浄バッファー 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8.カルモジュリン溶出バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9.現像液(1L) 37%ホルムアルデヒド 30 g炭酸ナトリウム 1000ml蒸留水 10。消化バッファー 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11.0.1%ギ酸 > <12 jove_step">12.洗浄液 0.1%ギ酸2O>