タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin vitroアッセイである。また、プリオン検出アッセイとして使用することができます。
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この記事について
サマリー
要約
プリオンは、動物とヒト9,18で必然的に致命的な伝達性 海綿状脳症（TSE）を引き起こす感染性病原体である。プリオンタンパク質は、2つの異なるアイソフォームは、非感染性宿主でエンコードされたタンパク質（PrP C）および感染質（PrP Sc）は、PrP Cの8の異常に折り畳まれたアイソフォームを持っています。
プリオン剤での作業の課題の1つは、ホスト13接種後の臨床徴候の開発の前に長い潜伏期間があります。これは、伝統的に長く、高価な動物のバイオアッセイ研究を命じた。さらに、PrP Scの生化学的および生物物理学的特性はあまり彼らの異常なコンフォメーションと凝集状態に起因する特徴がある。
PrP Sc は 試験管 14 内 の PrP ScへのPrP Cの種子変換することができます。 PMCAはアドバを取るのin vitro手法ですのPrP CとPrP Scの種子19微量の過剰な量を含んでいるシステムから、加速度的に、PrP Scのを大量に生成するために超音波処理およびインキュベーションサイクルを使用してこの能力のntage。この手法は、効果的にプリオン株の干渉をエミュレートするためには、PrP CからPrP Scの変換の種および株特異性を再現するために、感染した組織、体液、および環境試料6,7,16からPrP Scの非常に低いレベルを増幅することが証明されています23。
一貫性のある結果を生成し、それらの結果を定量化、汚染を最小限にするための提言を含め、本稿では詳細PMCAプロトコルを、。我々はまた、感染性プリオン株、プリオン株の干渉、及び環境中のプリオンの検出の発生と特性化など、いくつかのPMCAアプリケーションを、議論する。
プロトコル
1。機器の準備
- Misonix 3000または37の温度を一定に保つためにサーモエレクトロンNeslab EX-7水槽（ニューイントン、ニューハンプシャー州）に接続Misonix 4000ソニケーター（ファーミングデール、ニューヨーク州）℃を使用するサーモサイエンティフィック（ウォルサム、マサチューセッツ州）から入手したドーム型のキャップ付き200μlの薄壁PCRチューブストリップのサンプルを超音波洗浄します。
- 真新しいソニケーターは連続運転9の"慣らし"期間を必要とします。 2ヶ月のブレークイン期間は10に設定されて振幅レベルを持つ40秒の超音波処理バーストと10分インキュベーションサイクルで構成されています。一つはチタンプレートホーン（ 図1、パネルB）の表面全体に浸食を確認する必要があります。循環水は、チタンマイクロホーンの浸食による白濁を見ていきます。毎日この水を交換してください。
- PrP Scの増幅は、マイクロプレートホーンを通して変化します。最高のPrP Scの増幅効率が内に取得することができるマイクロホーンの中心から5cmの半径（ 図1、パネルCを参照してください）。
- PMCAの一周は144サイクルで構成されています。各サイクルは、5秒の超音波処理し、10分間のインキュベーションで構成....
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結果
タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はin vitroで 7 におけるPrP Scは、12、14、19、24を増幅するために使用されます。 図3に示すように、成功したPrP Scの増幅が PK耐性プリオンタンパク質（ハムスター由来のプリオン株の19および30kDaの間の移行）のウエスタンブロットのバンド強度の増加によって示されている。後のバンド強度の増加PMCAはPK耐性PrP Scの物質の増幅を示しています。ハムスター由来のプリオンタンパク質、HaCWDとDY TMEの成功は、PMCA増幅前（レーン5および7）、（レーン4,6）後のバンド強度を比較することにより、 図3のWB分析に示されている。
PrP ScのPK消化は、それぞれジ、モノ、および非グリコシル化型プリオン蛋白質に対応する、ア.......
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ディスカッション
感染性プリオンタンパク質を増幅するという課題は、長い潜伏期間および in vivo実験での経費です。 PMCA技術は感染性プリオンエージェントを増幅するための費用効果的な手段です。いくつかの研究室では、正確に試験管 7、9、12、14、19,24 のプリオン株を増幅するPMCAの能力を確認しています。
プリオン病は、種間で送信することができます。 Bessenとマーシュは効果的に二つの異なるハムスター由来のプリオン株5を生産伝染性ミンク脳症、とハムスターに接種した。エレガントな研究では、シカ科のPrP Cが点（Tg（CerPrP）1536 + / - ）を発現するトランスジェニックマウスを使用して、RML、占いや同僚マウス由来のプリオン株を増幅するsPMCAを使用PMCA基板としての。疾患の迅速な開始は、Tgの接種（CerPrP）後に観察された1536 + / - PMCA適応材料12と。同様に、クルトらが.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
我々は、原稿の批判的な読みのために博士はヴェスパーのFeマリーラモスに感謝したいと思います。この作業は、研究資源のためのナショナルセンター（P20 RR0115635-6、C06 RR17417-01とG20RR024001）と国立神経疾患研究所およびストローク（2R01 NS052609）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/機器 | メーカー | 猫。数 | |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbroeckティッシュグラインダー | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7ウォーターバス | サーモエレクトロン | Neslab EX-7 | |
| 0.2ミリリットルのPCRチューブストリップ | サーモサイエンティフィック | AB-0451 | |
| トリトンX-100 | シグマアルドリッチ | T9284-100ML | |
| コンプリートプロテアーゼインヒビター | ロッシュ | 11 697 498 001 | |
| EDTAを | JTベーカー | 4040から00 | |
| DPBS | マリンクロット·ベイカーメディアテック | 21から031-CV | |
| Versi-ドライラボSoakers | フィッシャー·サイエンティフィック | 14 206 28 | |
| REPTIサームヒーター | 動物園メッド·ラボラトリーズ社 | RH-4 |
参考文献
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C.
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再版と許可
