Method Article

Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

DOI:

10.3791/4080

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June 25th, 2012

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1Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 2Department of Cellular & Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは1つが糖尿病の治療のための潜在的な治療標的を見つけるために機能的なβ細胞量を調節する因子を同定することができます。プロトコルは、アデノウイルスによる遺伝子発現の操作後に膵島の複製と分離されたラット膵島のβ細胞機能を評価するための効率的な方法で構成されています。

Abstract

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グルコース恒常性は、主にそれぞれ、膵臓のβとα細胞から分泌され、内分泌ホルモンのインスリンとグルカゴンによって制御されます。機能β細胞塊を解剖ベータ細胞塊など栄養素の負荷に対応するβ細胞の能力によって決定されます。機能β細胞量の減少は、糖尿病1-3の両方の主要な形態の中心となります。 1型糖尿病の自己免疫攻撃から減少し、機能β細胞塊の結果に​​対し、2型糖尿病では、この減少は、適切なインスリンを分泌するβ細胞の無力とメカニズムの幹部からベータ細胞の破壊の両方から開発しています。従って、機能β細胞量を復元するための努力は、より良い治療と糖尿病の潜在的な治療に最も重要なことです。

努力は複製を刺激し、β細胞の機能を強化するために悪用される可能性が分子経路を特定するために進行中です。理想的には、治療の目標は、β細胞の増殖と機能の両方を向上させるだろう。しかしおそらくもっと重要なβ細胞の増殖を刺激する戦略は、β細胞機能（例えば、いくつかの遺伝子と同様に）、およびその逆を損なうことの代償かどうかを識別することである。

単離したラット膵島 ​​における標的遺伝子の発現を体系的に抑制または過剰発現することによって、人が増えて、機能のベータ細胞塊4-6の潜在的な治療標的を識別することができます。アデノウイルスベクターは、単離されたラット膵島​​4,7-15で効率的に過剰発現やノックダウンの蛋白質に用いることができる。ここでは、アデノウイルス形質導入を利用して遺伝子発現を操作し、膵島の複製と分離されたラット膵島 ​​のβ細胞機能（ 図1）を評価する手法を提案する。このメソッドは、β細胞の複製または関数5,6,8,9,16,17を調節する新たな標的を識別するために以前に使用されています。

Protocol

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1。ラット膵島のアデノウイルス形質導入と培養

  1. 必要な数にメディアの2ミリリットル（8 mMグルコース、10％ウシ胎児血清、50ユニット/ mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地）を添加することにより、6ウェル非組織培養コーティングしたプレートを準備します。井戸。無ウイルスの制御のためのそれぞれ、ウイルス制御（例えば、GFPを発現するアデノウイルス）、および実験群 - 例えば、典型的な実験は、3つのウエルが必要な場合があります。
  2. 少なくとも30分間組織培養インキュベーターにそれを置くことによって37℃にプレートを温める。
  3. すぐに6ウェル非組織培養コーティングしたプレートの各ウェルに、ラットの膵島分離18,19、場所100から200島を後に。シックス膵島インスリン分泌とチミジン取り込みアッセイに必要とされる。残りの島は、遺伝子発現の研究​​や免疫ブロット法のためのタンパク質分離のためのRNAの分離に使用することができます。

[注：この時点から、バイオハザード物質の取扱い、使用、廃棄のための制度のプロトコルに従ってください。]

  1. 優しくスワールウェルの中央に島をもたらすプレート。
  2. 皿の中央にある小島に直接アデノウイルスをピペット。感染症の100から500多重....

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Discussion

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複製を刺激し、β細胞の機能を強化するために調節することができる確立する経路は、糖尿病の両方の主要な形態に関連しています。機能β細胞塊は、これらの決定を評価し、インスリン分泌細胞の存在と機能に依存しているため、同時にその利点を持っています。このプロトコルは、タンパク質の過剰発現または抑制し、in vivoでの有効性をテストすることができ、in vitroで機能的なβ細胞量の変化につながるかどうかを識別するために合理化されたプロトコルについて説明します。

このプロトコルの1つの制限は、膵島を含む多くの細胞型から構成される微小器官ですが、アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、およびPP細胞に限定されないということです。ラット膵島の細胞の80-90％がβ細胞であるため、膵島のレプリケーションの変更が完全にβ細胞の複製の変化に翻訳することはできません。膵島における可能性、その観測された変化レプリケーションは、複製が存在する非β細胞によるものである。したがって、このプロトコルには、論理的確証次のステップでは、免疫蛍光またはFACS分析5,6

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Disclosures

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利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgements

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この作品は、NIH（PTFまで）からの助成金DK078732によってサポートされていました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
RPMI 1640培地ギブコ 11879
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ 15140
6ウェルプレート BD-ファルコン 35から1146 非TC扱わ
[メチル- 3 H] -チミジンパーキンエルマー NET027Z001MC 1 mCiの/ mlの
マイクロ遠心チューブデンヴィル C2170 1.7ミリリットル
NaClをシグマ 59888
塩化カリウムアクロス 42409
KH 2 </ SUB> PO 4 アクロス 20592
MgSO 4で アクロス 41348
CaCl 2を アクロス 34961
HEPES シグマ H0887 1 M溶液を
35パーセントBSA シグマ A7979
NaHCO 3を アクロス 42427
D-グルコースシグマ G8769
TCA フィッシャー·サイエンティフィック SA9410-1 の10％w / vの
NaOHでアクロス 12426
シンチレーション計数管ザルスタット 58.536 7ミリリットル、PP
シンチレーション計数管のキャップザルスタット 65.816
エコノセーフカウントカクテル RPI 111175
インスリンRIA ジーメンス TKIN2
BCAアッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック 23250
機器
遠心分離エッペンドルフ 5415R
シンチレーション計数管ラックザルスタット 93.1431.001
液体シンチレーションカウンターパーキンエルマートライ炭水化物2910TR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
  2. Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E.

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Beta Cell FunctionAdenoviral TransductionIsolated Rat IsletsInsulin Secretion AssayTritiated Thymidine IncorporationGlucose HomeostasisFunctional Beta Cell MassAdenoviral OverexpressionGene Expression ManipulationCell Replication Analysis

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