に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する C.エレガンス

サマリー

Oの定義された濃度の雰囲気を生成するために、連続フロー酸素チャンバーを使用する方法を本論文の詳細 ₂生物学的応答を理解するためにOを減少する ₂。このシステムは、セットアップと保守が容易で、Oの広い範囲に合わせて十分な柔軟性があり ₂濃度とモデルシステム

要約

酸素は、既知の例外の1つ¹で、すべての後生動物が生き残るために不可欠である。減少したO ₂可用性（低酸素）は、環境条件^2-5の病気、通常の開発や変更の状態の間に発生する可能性があります。低酸素への応答に関与する細胞内シグナル伝達経路を理解することが脳卒中からがんまで、多様な人間の病態の治療戦略に新たな洞察を提供することができます。この目標は、遺伝的影響を受けやすいモデル生物で制御された低酸素曝露に伴う技術的困難により、少なくとも部分的に妨げられてきた。

線虫 Caenorhabditis elegans は、理想的にはそれが文 ​​化に容易であり、遺伝的操作として、低酸素応答の研究のためのモデル生物として適しています。また、C.以降の交絡影響を及ぼすことなく特定の酸素O ₂濃度に対する細胞応答を研究することが可能ですelegansは O _2を得る（容易に呼吸器系⁶とは対照的に、拡散による）ガスや他の。低酸素に対する応答に関与することが知られている要因は、Cで保存されているエレガンス 。低酸素状態への実際の応答が可能ですO ₂の特定の濃度に依存する。 C.でelegansは 、低酸素症を緩和するための露出がHIF-1によって主として媒介転写応答を誘発する、高度に保存され低酸素誘導転写因子^{6-9。C。elegans}の初期胚では、O ₂ ^7,10 5,000-20,000 ppmで生き残るためにはHIF-1を必要とする。低酸素状態は"通常のO ₂未満"のための一般的な用語です。正常酸素（通常のO _2）も定義することが困難な場合があります。我々は一般的に正常酸素であることが21万ppmのO ₂であり、室内の空気を、検討してください。しかし、それは示されているC. elegansは 5から12パーセントからO ₂濃度（50,000-120,000 ppmのO ^_2）11の行動の優先順位を持っています。 lのarvaeと大人、5,000 ppmのO ₂ ¹²に低酸素誘導休眠を防止するために、HIF-1として機能します。しかし、HIF-1は、O ₂の低濃度（酸素欠乏、操作的定義<10 ppmのO ^_2）13に対応して役割を果たしていない。無酸素症、Cの虫はすべて微視的に観察活動が^10を停止した仮死状態の可逆的な状態に入る。異なる生理的応答は、さまざまな条件で発生するという事実は、O ₂の酸素濃度以上の実験的なコントロールを持つことの重要性を強調しています。

ここでは、O ₂の濃度と定義された信頼性と再現性の低酸素状態を作り出す環境槽の建設と実施のための手法を提案する。継続的なフロー法は、チャンバーの急速な平衡を保証し、システムの安定性を向上させます。さらに、透明性とチャンバーのアクセシビリティは、低酸素状態にさらされる動物の直接可視化を可能にします。我々はさらにCを収穫する効果的な方法を実証虫のサンプル急速に低酸素に曝露した後、これは低酸素症^10,14で発生し、急速に逆の変化の多くを観察する必要があります。このメソッドは、簡単に別のモデルシステムとガスの多様など、個々の研究室のニーズに合わせて修正することができる基本的な基盤を提供します。

プロトコル

1。環境チャンバーの建設

1. プロジェクトのスコープのために必要な室の中で最小の合理的なボリュームを選択します。チャンバーは、ガス（O _2）不浸透性材料で作られている必要があります。パイレックスの結晶皿、Anaeropackボックス、または大規模なキャストアクリルボックス（Ellardインスツルメンテーション）は、使用することができます。我々は、9 50 mmプレートは100×50 Kimex結晶皿に収まることを発見した。ガラス板は、パイレックスの結晶皿の蓋として使用することができます。
2. 選択されたチャンバ内に穴を開けるとホースバーブフィッティング（コールパーマー）にルアープラスチック男性と合う。継手は、管継手、またはエポキシ樹脂で固定することができます。ガス室からの流れとすることを可能にするために容器の反対側に同様のフィッティングをインストールします。可能であれば、乱流混合を高めるために穴をオフセット。
3. O _2、COのための標準を認定されて定義されているO ₂濃度（N ₂とのバランス）を使って圧縮ガスタンクを取得します。ntentまたは、酸素欠乏状態のために、（<10 ppmのO _2）2 N純粋。チャンバ内の酸素濃度を中断することを避けるために自動スイッチオーバーの長期的研究のためのレギュレータを使用してください。
4. 低酸素に生物体の応答は温度依存性¹⁵であることが示されている。インキュベーターに室を配置することによって、様々な温度を維持することができる。インキュベータ内の温度が不均一となどかもしれないが、それは常にチャンバー内の温度を測定する温度データロガーを利用することが賢明です。

2。環境室にガスを接続する

1. すべての接続の場合は、スナップコネクタまたは圧縮継手のどちらかによって接続さ8分の1インチの外径のチューブを使用しています。チューブは、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）またはナイロン（コールパーマー）として、O ₂の不浸透性及び非反応性でなければなりません。完了したセットアップの概略については、 図1を参照してください。
2. COMを接続するこのような質量流量コントローラ（シエラ·インスツルメンツ）またはロタメーター（オールボ​​ー）として、流量制御装置へのガスのタンクを押した。タンクから上流圧力、フローデバイスの範囲とホースバーブ継手内にあることを確認してください。二段階のレギュレータは、一般的に所望の圧力に設定して第二段階で使用され、[適切な流量を選択するためのセクション3を見る]
3. （ 図1を参照）の排気のためのオープン第2嵌合を残して、その後ガスを使用して蒸留水を介してバブリングによるガスフリットシリンダーでボトルを洗浄し、環境室の継手のうちのいずれかに直接水和物。短期試験では、ガスの水和は、プレートdessicationに対する保護が、湿度のモニタリングは、長期的な研究のために必要となる場合があります。
4. ダウコーニングの真空用グリースは、チャンバを密閉するために使用することができます。気密シールを確保するため、チャンバーの蓋に重みを置きます。密封し、適切な流量を確認するには、yの手のひらに少量の水のプールを保持する私たちの手袋をしたチャンバーでアウトフィッティングに手や気泡を確認してください。

3。フローレートを選択する

1. 完全混合を仮定し、気体の大気の90％のガス交換するたびに、チャンバの容積が（フィックの法則）に置き換えられますがあります。たとえば、100 cc /分の流量で100ccのチャンバー内に、チャンバー内の元の家の空気は、1分後に所望のガスの90％に置き換えられますし、漸近的に90パーセント分ごとにすることで、完全な交換に近づきますその後。
2. 高流量と小型コンテナは、より迅速に、ご希望の酸素濃度に到達します。 100×50 Kimexコンテナ（400 cc）で、120 cc /分の流量は10分（3取引所）で99.9％の交換に到達します。この流量は、ほとんどの酸素条件に適しています。我々の知識にO ₂濃度の変化率は、Cの応答をどのように影響するかを系統的に調査がされていませんエレガンス 。

1. 低酸素状態にさらされたワームは、一般に寒天プレートの表面をエスケープします。これを防ぐために、プレートの縁の周りにパルミチン酸（エタノールでは10 mg / ml）のリングを配置します。パルミチン酸は、物理的なバリアを形成し、エタノールを蒸発させた溶液から出てくるでしょう。パルミチン酸の障壁は 、C言語の産卵率、産卵数や寿命に影響を与えません虫 ^16,17。穴掘りは、低酸素条件下でより頻繁に発生しないので、追加の予防措置は、一般的に必要ありません。
2. 1. 非シード線虫の成長培地（NGM）プレート¹⁸上にアルカリ性漂白溶液の小滴に妊娠大人の漂白によって同期集団を生成します。標準的な大規模バッチの次亜塩素酸漂白プロトコルとは対照的に、NGMプレートの表面に漂白剤溶液の液滴で1から100の動物を選択し、漂白剤溶液をプレートに吸収することができます
   2. これは生存率^13を減らすこと^ができるように、低酸素に漂白された胚を露出させることは避けてください。若い胚（2-4セル）を収集するために、妊娠、大人の酸素への後続の露出のために口のピペットでプレートに移動したかみそりの刃と胚の水の少量のみじん切りにすることができます。
3. 環境チャンバー内でプレートをシールします。対照動物は、治療のワームと同じ温度で正常酸素（空気の家）に保持する必要があります。家の空気中に放置サンプルと家の空気がその上を流れると同一の​​チャンバー内に維持、それらの間に観察可能な違いはありません。ガスフローを開始し、希望の時間のために露出を維持しています。ランプの均一性を確保するため、必ず曝露前のガス洗浄瓶に水を交換してください。
4. 胚のアッセイの生存に、ワームは、室内の空気に復帰した後48時間開発することができ、彼らは1つ大人4段目の幼虫/日でなければなりませんその時点で。生存、検閲を占めていることはできませんいずれかのワームのスコア。
5. 、低酸素に暴露した動物を視覚化する22ミリメートル²カバースリップ上でM9のドロップにワームを移動し、M9 ¹⁸に、2％アガロースのパッド上に反転します。必要な場合は、レバミゾール（25 mm）またはアジ化ナトリウム（10 mM）を麻酔薬として使用することができます。アジ化ナトリウムとレバミゾールは、毒性のためにいくつかの観測を混乱させる可能性があり、慎重に^19を使用する必要があります。

5。低酸素に暴露されたワームの急速な収穫（例：HIF-1ウェスタン分析用サンプルの調製）

多くの低酸素誘導効果はすぐに卵の生産^12、有糸分裂エピトープのリン酸化の再開など、室内の空気に戻った時に逆になっている胚¹³とHIF-1タンパク質の分解^9,20インチ低酸素状態にさらされる動物の急速な分離は、これらの条件で再現性の効果を得るために必要とされています。 2分未満で、このセットアップでは、動物を収穫することができ、液体窒素で凍結。グローブボックスの低酸素室は無酸素条件下での試料の操作を可能にする一方で、無酸素以外の条件のために、コストと実用性は、その有用性を制限します。

1. ワームの大半は^18歳妊娠成人になるまで4〜10センチの高成長（HG）プレート上にブリストルN2ワームを育てています。ワームは5分⁹以上ではなく、溶解し始めるまで回転で1:5アルカリ性漂白溶液とインキュベートを含む15 mLコニカルチューブにワームを洗ってください。ブレーキなしで各洗浄の間に1500 xgでスピンダウンし、M9とワームを3回洗浄します。
2. 8 150 mmのNGMプレート上にプレートを漂白した胚およびL4幼虫（22時ブリストルN2の〜48時間°C）に発展することができます。環境チャンバーにプレートを移動し、4時間の低酸素（1,000 ppmで、5,000 ppm）と酸素（N2）の条件に公開します。露光時間は、実験デザインに応じて異なります。低酸素への曝露が産卵率に直接的な影響を持っていますが、2細胞期胚では、暴露¹²の16から18時間後に死亡しています。この低酸素室での設定は、曝露の下限は平衡に達するために必要な雰囲気の為替レートによって制限されます。
3. ラベル1 1.5mlマイクロチューブと各実験サンプルの1つの15 mLコニカルチューブ。低酸素状態にさらされたワームは、収穫時のチューブの側面に付着する可能性が高くなります。これを防ぐために、場所ごとに15 mLのコニカルチューブに1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の100μL。 SDSは、下流のアプリケーションを阻害する場合、（BSA）ウシ血清アルブミンは、付着を防止するために使用することができます。 SDSまたはBSAの日常的な使用が明らかに違いを持っ​​ていないようです。 2倍のタンパク質をローディング色素（4％SDS、10％2 - メルカプトエタノールと50μlを加える1.5mlマイクロチューブに30％グリセロール（w / v）の）のブロモフェノールブルーのトレース。液体窒素デュワーの準備ができている。
4. 低酸素症およびレコードからワームを除去した後、時間ステップを。 、低酸素室に蓋を取り外しつのサンプルプレートを取得し、チャンバーを封印。 15 mLのコニカルチューブに注ぎ、次にナイロンフィルター上にワームを洗浄し、蒸留水を使用しています。ブレーキ付15〜20秒の場合は1500×gで遠心分離し、デスクトップにワームをスピンダウンします。
5. 手付かずのワームペレットを残して、チューブから上清の大部分を削除するには、真空を使用しています。
6. ピペットを用いて、1.5mlマイクロチューブに50μLのワームペレットを移動します。液体窒素中でチューブと浸漬をシールします。
7. すべてのサンプルが分離されているまで繰り返します。一貫性を保つために家の空気のコントロールサンプルのためにこれらの手順に従ってください。サンプルは-20℃で保存することができます

6。代表的な結果

低酸素症の生物体の効果を見ることができますCの成人に可能性を調べることによって、 線虫 （ 図2）。野生型ブリストル（N2）とHIF-1（ia04）の欠失変異体によって築かれた胚は、すべての家エアO ₂濃度（210,000 ppmのO _2）の中で生き残るされています。 HIF-1胚が実行可能ではないながら、N ₂のワームは、5,000 ppmのO ₂の成人に適応し、生き残ることができます。これは、HIF-1は、環境¹⁰で利用可能な酸素レベルの変化に適応するために不可欠であることを示している。いずれもN2もHIF-1の動物は、1,000 ppmのO ₂への暴露に耐えることができます。

低酸素に直接ワームを視覚化することは解剖の範囲と透明容器（ 図3）の使用で可能である。直接解剖スコープの低酸素室を配置することによって、生物体の反応を観察するために低酸素状態からワームを削除する必要はありません。範囲は（ 図3のように蛍光illumationを取り付けることができます。

図1。低酸素室の一例。ガス流の方向が矢印で示されています。ガスが定義されているO ₂濃度（1）と2つの段階のレギュレータに圧縮ガスタンクに格納されている（2）接続されています。ガスは、適切な流量でトップを終了し、フローチューブの底に（3）に入ります。ガスは、ガス（気泡を観察することによって、バブルフラスコの正しい接続を確保するため）水和、バブルフラスコ（4）に流れ込みます。和ガスは、低酸素症にサンプルを公開し、流入弁（5）で低酸素室に渡します。チャンバー内で掘削し、排気孔を介して部屋にガスがようやく口。

図2。 1,000 ppmのO ₂にさらされた胚の生存率、5,000 ppmのO _2）。胚は連続フロー酸素室で24時間の胚のように各酸素状態にさらされた。 ワームは、正常酸素条件に移動し48時間大人に開発することができ、その後成人期への生存率を評価した。 N> 50、N = 5。

図3。 C.の可視化顕微鏡による低酸素状態でエレガンス 。ワームは、概説の方法を用いて低酸素状態にさらされています。透明な環境室（パイレックス結晶皿とガラス板で構成）解剖範囲のステージ上に直接配置されています。 2つのビューは、全体のガスの流れを含むいずれかの顕微鏡のステージ上だけチャンバと、他のを設定し、表示されます。

ディスカッション

このメソッドは、実験室で維持される酸素の正確な濃度の環境を可能にする低酸素環境を構築するための戦略を提示します。これらのチャンバは、O _2、特定の低濃度に生物を暴露し、分子および生理学の出力を監視するための簡単な方法を提供しています。説明した環境室は、ラボの代わりに市販品を購入することによって作成されたため、実験のニーズに合わせて変更することができます。

この方法の一つの明確な利点は、連続フロー設計になっています。これは通常、外部のO ₂濃度がはるかに高い場合（室内空気21万ppmのO _2）チャンバー内でO ₂の低濃度を維持することで発生する困難を排除します。代わりに、低酸素環境は、密閉チャンバ内で維持されているストップトフロー法である。検出が困難になる可能性が少しでも漏れ、プリストップトフロー法を用いて低酸素状態の維持を発散。圧縮空気タンク内の定義されている酸素濃度の連続フロー法継続的に交流室内の空気と低酸素状態を中断することから、リークを防ぎ正圧を維持しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
チューブ（FEPとPTFE）	コー​​ルパーマー タイゴン	YO-95821から00（1/8 "FEP） 06605から27（1/16×1/8 "PTFE） 'R-3603
コンプレッション·フィッティング	シアトル流体システム	06363から58（Mカプラー1/16 "） 06363から62（F.カプラ1/16 "） 06363から60（Mカプラー1/8 "） 06363から61（F.カプラ1/8 "）
流管	オールボルグ	PMR3-010073（3出力） PMR1-013520（1出力）
マスフローコントローラ	シエラ·インスツルメンツ	810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1（マスTrakの） C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10（スマートTrakの2）
圧縮ガスタンク	Airgasの	オーダーメイド
ホースバーブフィッティングにルアープラスチック男性	コー​​ルパーマー	45505から41（500シリーズ1/16 "）
アクリルボックスをキャスト	Ellard装	オーダーメイド
管継手（黄銅またはステンレス鋼）	シアトル流体システム	B-402-1（1/4 "ナット） B-200-3（1/8 "ユニオンティー） B-400セット（1/4 "フェルール） B-QM2-B1-200（QMボディQC） B-200-1-2（1/8×1/8 "オスCONN）
ダウコーニングの真空用グリース	Sigma-Aldrich社	Z273554
AnaeroPackボックス	Misubishiガス·ケミカル·カンパニー	R684004（0.4リットル） R685025（2.5リットル） R685070（7.0リットル）
パイレックスガス洗浄瓶	Sigma-Aldrich社	CLS31770500C（500 mL）を CLS31770250C（250 mL）を CLS31770125C（125 mL）を
パルミチン酸	Sigma-Aldrich社	P0500
ヤギ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ	サザンバイオテクノロジーアソシエイツ	1032年から1005年
SuperSignal西ピコChemiluminsecent基板	ピアスケミカル	34077
100×50ガラスの結晶皿	Kimaxキンブル	23000