Method Article

PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

DOI:

10.3791/4091

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August 13th, 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

In This Article

Summary

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嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、上皮クロライドチャネルは、様々なタンパク質と相互作用し、重要な細胞プロセスを調節することが報告されているそれらの間でCFTR PDZモチーフを介する相互作用は十分に文書化されています。このプロトコルは、我々は複雑なシグナル伝達PDZ-依存性のCFTRの高分子を組み立てるために開発された方法について説明します。 in vitroで。

Abstract

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嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、主に上皮細胞の頂端膜に位置するクロライドチャネルは、1〜3上皮液の恒常性に重要な役割を果たしている。嚢胞性線維症（CF 4）及び分泌性下痢5：CFTRは、二つの主要な疾患に関与している。 CFでは、CFTRのCl-チャネルの合成または機能活性が低下します。この疾患は、米国6の約1 2500の白人に影響を与えます。過度のCFTR活性はまた、腸内7でcAMPまたはcGMP産生を刺激する毒素によって誘導される分泌性下痢（例えば、コレラ毒素と熱安定性大腸菌エンテロトキシンによる）の症例に関与している。

証拠を蓄積すると、CFTRとトランスポーター、イオンチャネル、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、信号を含む他のタンパク質の増加との間の物理的および機能的相互作用の存在を示唆る分子および細胞骨格要素、およびCFTRとその結合蛋白質との間でこれらの相互作用が非常にin vitroおよびin vivoでも8-19に CFTR媒介上皮イオン輸送の調節に関与していることが示されている。このプロトコルでは、メソッドだけに焦点を当て、そのタンパク質結合モチーフを持っているCFTRカルボキシル末端尾部の間の相互作用の研究を支援し、[モチーフPSD95/Dlg1/ZO-1（PDZ）と呼ばれる] PDZドメインと呼ばれる特定の結合モジュールが含まれている足場タンパク質のグループ。これまでのところ、いくつかの異なるPDZ足場タンパク質は、そのようなNHERF1などの様々な親和性、NHERF2、PDZK1、PDZK2、CAL（CFTR関連リガンド）、Shank2とCFTRのカルボキシル末端尾部に結合し、20から27を把握することが報告されている。 PDZ足場タンパク質によって認識されているCFTR内PDZモチーフはC末端（すなわち、ヒトCFTRの1477-DTRL-1480）20最後の4つのアミノ酸である。興味深いことに、CFTRは、様々な親和性を22とはいえ、NHERFsとPDZK1両方の複数のPDZドメインをバインドすることができます。 CFTRの結合に関しては、この多価は、PDZ足場タンパク質は、細胞16から18の特定/選択的かつ効率的なシグナリングのためのシグナル伝達複合体CFTRの高分子の形成を促進する可能性が示唆された、機能的意義のあることが示されている。

複数の生化学的なアッセイは、CFTR-含むそのような共免疫沈降、プルダウンアッセイでは、ペアワイズ結合アッセイ、ペアワイズ結合アッセイ比色し、高分子の複雑なアセンブリアッセイ16-19,28,29としてタンパク質相互作用を研究するために開発されている。ここでは、CFTR 16-19,28,29を含むタンパク質-タンパク質またはドメインドメインの相互作用を研究する我々の研究室で広く使用され、in vitroでのPDZモチーフに依存したCFTR含有高分子複合体を組み立てるの詳細な手順に焦点を当てています。

Protocol

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1。細菌における組換えHisタグ融合タンパク質の発現および精製

  1. CFTR、LPA 2、MRP2、MRP4、β2 AR、そしてNHERFs（フルレングスまたはPDZ1またはPDZ2ドメインのC-テイル（C末端にPDZモチーフを含む最後の50から100アミノ酸）の定義された領域を増幅するPCR法による）。
  2. そのようなMBP-β2 AR CT、MBP-CFTR CTとしてMBP融合タンパク質（詳細については、GST-融合タンパク質のpGEX4T-1ベクター（例えば、GST-NHERFsとして、GST-MRP4 CT）やpMal-C2ベクターにPCR産物をクローニングし）、および彼の-S-融合タンパク質（例えば、彼の-S-CFTR CT、彼の-S-PDZK1など）のpET30。
  3. プロテアーゼ欠損E.に変換大腸菌株（BL21-DE3）可能な組換えタンパク質の分解を最小限に抑えます。
  4. 適切な抗生物質（例えばアンピシリンまたはカナマイシンなど）を含むルリア - ベルターニ培地（pH7.0）に37°Cで一晩培養する。 1:10に一晩培養物を希釈し、37℃でさらに2時間のために育つ℃、で0.5〜1メートル、Mは 30℃で、次の4時間IPTGでduce 8000遠心分離によってペレットは、細胞×gで10分間4℃で
  5. （50メートルMトリス-HCl....

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Discussion

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このプロトコルでは、前述の16-19,29,30を報告した in vitroで組み立て、精製タンパク質（またはタンパク質断片）および/ ​​または細胞ライセートを用いて高分子シグナル伝達複合体を含むCFTRの検出方法を示した。最良の結果を達成するための準備プロセス中に次の重要なポイントは、特別な注意が必要です。

  • これは、溶出緩衝液のpHは、ステップ1）で説明したように、GST-融合タンパク質を精製する際に還元型グルタチオンを添加した後8.0に調整することが重要です。 pHは、還元型グルタチオンを添加した後3.0などのように低くなることができます。 pHが溶出する前に調整されていない場合は、溶出の効率が大幅に削減されます。
  • タンパク質がビーズから溶出されたとき、彼らはすぐに透析する必要があり、それ以外の場合は、精製タンパク質が溶液から出てくるかもしれません。蛋白質の透析は、右の溶出プロセスの後に可能でない場合は、タンパク質を溶出し、目でそれらを残していない電子アガロース/ビーズ。
  • それは強くCFTR凝集が共通の問題とし.......

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Disclosures

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利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgements

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私たちの仕事は、米国心臓協会（グレーター東南アジアアフィリエイト）昭和·助成金の0765185B、エルザU.パーディー財団研究助成金、ウェイン州立大学の学内のスタートアップ資金と血管研究所イシスイニシアティブ賞からの助成金によってサポートされています。 in vitroで CFTRの高分子複合体のアセンブリ内のこのメソッドは、もともと博士AP Naren（テネシー大学ヘルスサイエンスセンター）によって開拓された。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
pGEX4T-1ベクトル GEヘルスケア 28-9545-49 旧アマシャムバイオサイエンス
やpMal-C2ベクトルニューイングランドバイオラボ
pET30ベクトル EMDケミカルズ 69077から3 以前はNovagen社
グルタチオンアガロースビーズ BDバイオサイエンス 554780
アミロース樹​​脂ニューイングランドバイオラボ E8021S
タロンビーズクロンテック 635501
還元グルタチオン BDバイオサイエンス 554782
イミダゾールフィッシャー BP305-50
マルトースフィッシャー BP684-500
S-タンパク質アガロース EMDケミカルズ 69704から3 以前はNovagen社
抗Flag HRP シグマ A8592
抗CFTR抗体カスタムメード R1104 AA 722から734でCFTRのエピトープを認識するモノクローナル抗体
抗IgG抗体MRP2 ケミコンインターナショナル MAB4148 ミリポアの今一部

表2特異的試薬および装置。

References

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  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance r....

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CFTR Macromolecular ComplexPDZ dependent BindingCo immunoprecipitationPull down AssayWestern BlottingGST Fusion ProteinsHis tag Fusion ProteinsHEK 293 Cell LysatePDZ Scaffold ProteinsProtein Concentration Assay

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