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マイクロ流体カプセル化法は、これまでピコリットルスケールの水性単分散液滴中の細胞を捕捉するために利用されており、ハイスループットスクリーニング、サイトメトリー、質量分析などの用途でバルク流体環境からの閉じ込めを可能にしています。我々は、単一の細胞をカプセル化するだけでなく、一定数の細胞を繰り返し捕捉する方法(ここでは1細胞と2細胞のカプセル化を実証する)について説明し、制御されたサイズのグループにおける細胞間の単離と相互作用の両方を研究します。ドロップジェネレーション技術と細胞および粒子の秩序化を組み合わせることで、細胞サイズの粒子の制御されたカプセル化を実証し、効率的で連続的なカプセル化を実現します。水性粒子懸濁液と非混和性フッ素油を使用し、フローフォーカシングノズルで油中に水滴を発生させます。水性流量は、液滴生成周波数の整数倍周波数でノズルに到達する粒子の秩序を作り出すのに十分高く、各液滴に制御された数のセルをカプセル化します。代表的な結果を得るために、9.9μmのポリスチレン粒子を細胞の代替物として使用します。 この研究では、それぞれ39.3%と33.3%のそれぞれのポアソン効率と比較して、1粒子カプセル化効率Pk = 1と79.5%の単一粒子カプセル化効率P k = 1と79.5%を示しています。細胞と粒子の濃度が一定であることの影響は、効率的なカプセル化にとって非常に重要であることが実証されており、ドリップからジェットへの移行にも対処しています。
はじめに
連続培地水性細胞懸濁液は、細胞が並行して相互作用することを可能にする共通の流体環境を共有し、培地からの測定値における特定の細胞の影響を均質化します。細胞をピコリットルスケールの液滴にハイスループットでカプセル化することで、サンプルを閉じ込めて液滴を交差汚染から保護し、サンプル内の細胞多様性の測定を可能にし、試薬や発現バイオマーカーの希釈を防ぎ、バイオリアクター製品からのシグナルを増幅します。滴は、液滴をより大きな水性サンプルに再結合したり、細胞間シグナル伝達研究のために他の液滴と再結合する機能も提供します。1,2 希釈率の低下は、より高精度な測定のためのより強力な検出信号と、潜在的に高価なサンプルと試薬の量を減らす能力を意味します。3 液滴中の細胞のカプセル化は、ハイスループットスクリーニングのためのタンパク質発現4、抗体5、6酵素7、代謝活性8の検出を改善するために利用されており、ハイスループットサイトメトリーの改善にも利用できる可能性があります。9 その他の研究では、質量分析10および標的表面細胞コーティング用の液滴を含む細胞の生体エレクトロスプレーの応用が示されています。11 ただし、一部のアプリケーションは、液滴にカプセル化されたセルの数を制御する能力がないために制限されています。ここでは、1つおよび2つのセルについて実証されたカプセル化効率を増加させ、より多くのセルのカプセル化のために外挿され得る順序付けられたカプセル化12の方法を提示する。
単分散液滴生成を実現するために、マイクロ流体の「フローフォーカシング」は、ストリームが収束するノズルを使用して、1つの流体(水性セル混合物)を別の流体(連続油相)内に制御可能なサイズの液滴を生成することを可能にします。13 特定のノズル形状について、液滴発生周波数fと液滴サイズは、オイルと水性の流量QオイルとQaqを調整することで変更できます。流量が増加すると、流れは液滴発生からノズルからの水性流体の不安定な噴射に移行する可能性があります。14名
水溶液に懸濁粒子が含まれていると、粒子はノズルでカプセル化され、互いに分離されます。 ランダムに分布した水性細胞懸濁液を用いた液滴生成の場合、k個の細胞を含む液滴Dkの平均画分はポアソン統計によって決定され、ここでDk = λk exp(-λ)/(k!)、λは液滴あたりの平均細胞数です。「正しく」カプセル化された液滴に最終的に収まる細胞の割合は、Pk =(k x Dk)/Σ(k' x Dk')を使用して計算されます。2つの指標の微妙な違いは、Dkは水溶液の利用とカプセル化後に完了しなければならない液滴選別の量に関連し、Pkは細胞サンプルの利用に関連しつあることです。例として、希薄な細胞懸濁液(低λ)を使用して、細胞を含むほとんどの液滴が1つの細胞しか含まないところに液滴をカプセル化することができます。効率メトリックPkは高くなりますが、液滴の大部分は空(低Dk)であるため、空の液滴を除去するための選別メカニズムが必要であり、スループットも低下します。15名
ドロップ生成と慣性順序付けを組み合わせると、ドロップあたりのセル数がより予測可能で、ランダムカプセル化よりも高いスループットでドロップをカプセル化する能力が得られます。慣性フォーカシングは、Segre と Silberberg16 によって最初に発見され、有限サイズの粒子がチャネル フローの横方向の平衡位置に移動する傾向を指します。慣性秩序とは、粒子と細胞が等間隔の千鳥状の等速列に受動的に組織化する傾向を指します。フォーカシングとオーダーの両方に、十分に高い流速(高いレイノルズ数)と粒子サイズ(高い粒子レイノルズ数)が必要です。17,18ここで、レイノルズ数Re = uDh /νと粒子レイノルズ数Rep = Re(a / Dh)2、ここでuは特性流速、Dh [= 2wh /(w + h)]は水硬性直径、νは動粘度、aは粒子直径、wはチャネル幅、hはチャネル高さです。経験的には、完全に順序付けられた列車を達成するために必要な長さは、Re と Rep が増加するにつれて減少します。高いReおよびRep要件(この研究ではそれぞれ5および0.5のオーダー)は、液滴発生ノズルでの噴射を避けるために水性流量を低く保つ必要性と矛盾する可能性があることに注意してください。さらに、流量が多いとセルのせん断応力が大きくなりますが、これはこのプロトコルでは対処されていません。以前の順序付けられたカプセル化研究では、この研究と同様の流動条件下で単独でカプセル化されたHL60細胞の90%以上が細胞膜の完全性を維持したことが示されました。12 ただし、せん断応力の大きさと時間スケールの影響は、さまざまなセルタイプと流れパラメータに外挿する際には慎重に考慮する必要があります。細胞の順序付け、ドロップ生成、および細胞生存率の水性流量制約のオーバーラップにより、単一および複数の細胞の制御されたカプセル化に理想的な運用体制が提供されます。
粒子列の間隔を扱った研究はほとんどないため、間隔の決定は経験的に最も簡単に行われ、チャネルの形状、流量、粒子サイズ、および粒子濃度に依存します。それにもかかわらず、列車間の横方向の間隔が等しいということは、セルが予測可能で一貫した時間間隔で到着することを意味します。液滴生成が、注文された細胞がノズルに到達するのと同じ速度で起こると、細胞は制御された方法で液滴内にカプセル化されるようになる。この技術は、15 kHzのオーダーのスループットで単一細胞をカプセル化するために利用されており、12 60-160 Hzのオーダーでカプセル化率を報告している以前の研究よりも大幅に改善されています.4,15 制御されたカプセル化作業では、液滴の80%以上が1つの細胞のみを含み、ポアソン(ランダム)統計よりも大幅な効率改善が見られました。 これは、平均して40%未満の効率を予測します。12名
以前の制御されたカプセル化作業では、12 液滴あたりの平均粒子数 λ は、単一セルのカプセル化を提供するように調整されていました。私たちは、流量を調整することで、λが1滴あたりの所望の細胞数と等しいかそれに近い場合、1滴あたりの任意の数の細胞を効率的にカプセル化できるという仮説を立てています。シングルセルカプセル化は、刺激から個々の細胞応答を決定するのに役立ちますが、マルチセルカプセル化は、制御された細胞の数と種類の相互作用に関連する情報を提供します。ここでは、プロトコル、ポリスチレンミクロスフェアを使用した代表的な結果、および受動的な慣性秩序チャネルと液滴発生ノズルを使用した複数の細胞の制御されたカプセル化に関する議論を示します。