将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化
この記事について
サマリー
要約
ヒト唾液プロテオームとペプチドーが1-2を明らかにされているが、それらはすぎなかったトリプシン唾液タンパク質の消化物から同定された。外因性の酵素による事前消化せずにヒト唾液の先住民族ペプチドーの同定は、ヒト唾液でネイティブペプチドが疾患の進行を予測し、治療効果を監視し、病気を診断するための潜在的な値を提供するので、必須となります。適切なサンプリングは、人間の土着の唾液ペプチドーの識別の強化のための重要なステップです。 3から4の残骸を削除するには、遠心分離を含むヒト唾液をサンプリングする従来の方法は時間がかかりすぎるの臨床使用のために適用可能であることかもしれません。さらに、遠心分離による瓦礫撤去は、感染した病原体のほとんどをきれいにし、多くの場合、低濃度のペプチドーの識別を妨げる高濃度タンパク質を除去することができない場合があります。
PRI、従来のプロテオミクス的手法marilyゲル内消化との結合の二次元ゲル電気泳動（2-DE）ゲルは多くの唾液タンパク質の5-6を識別することができる利用しています。しかし、このアプローチは、一般的に低濃度のペプチド/タンパク質を検出するのに十分な小文字は区別されません。液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）ベースのプロテオミクス前の2-DE分離することなくタンパク質を識別することができる代替手段です。このアプローチは、より高い感度を提供していますが、それは一般的に臨床使用が困難になってトリプシンと以前のサンプルプレ分画7とプレ消化を必要とします。
サンプル調製のために質量分析の妨害を回避するために、我々は、キャピラリ限外濾過（CUF）プローブ8から11と呼ばれる技術を開発しました。我々の研究室からのデータは、CUFプローブは、ダイナミックかつ低侵襲な方法8の動物の様々な微小環境から、生体内でタンパク質を捕捉することが可能であることを実証-11。負圧は、サンプル収集中に撤退単に注射器によって作成されているので全く遠心分離は必要ありません。 LC-MSを組み合わせたCUFプローブが成功したトリプシン消化し たタンパク質の8-11を同定した。本研究では、簡単に人間の口腔内に収まることができロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブを作成することにより、限外ろ過サンプリング技術をアップグレードしました。トリプシン消化せずにLC-MSによる直接分析では、国産ヒト唾液は様々なタンパク質に由来する多くのペプチド断片が含まれていることを示した。 LLUFプローブと唾液をサンプリングする遠心分離を避けますが、効果的に多くの大規模、高濃度タンパク質を除去。私たちの質量分析の結果は、多くの低濃度のペプチドはLLUFプローブで大きなタンパク質をフィルタリングした後に検出されなったことを示す。低濃度の唾液ペプチドの検出は、クロマトグラフィーを持つ複数のステップのサンプルの分離独立していた。臨床応用のために、LLUFプローブが組み込まれてLC-MSとdが潜在的に唾液から疾患の進行を監視するために、将来的に使用することができます。
プロトコル
1。 LLUFプローブの作成
- ポリエーテルスルホン膜（2 cm 2の ） はパドルの境界線上にエポキシ樹脂接着膜により三角形のポリプロピレン製パドル（カリフォルニア大学サンディエゴ校）で密封した。 30 kDaの分子量カットオフ（MWCO）と負に帯電したポリエーテルスルホン膜を用いた。
- LLUFプローブは20 mlの注射器に接続することができますので、テフロンフッ素化エチレンプロピレンチューブ（内径/外径、0.35/0.50 cm）の三角形のポリプロピレンパドルのシリンダの出口に取り付けた。
- 培養皿（直径50mm）にヒト唾液中にポリエーテルスルホン膜を浸漬した後、負圧が注射器を取り出すことにより作成されました。負圧と注射器は、唾液からタンパク質をサンプリングするための限外ろ過プロセスを運転した。
- プローブは使用する前に、一晩70％アルコールで滅菌した。適切なシールを実証するために、我々触構造にLLUFプローブを配置し2時間2,000 kDaの平均分子量とブルーデキストラン（50 mg / ml）を含むる。採取した試料のブルーデキストランの不在は、漏れは、プローブの作製、サンプリング中に開発されないことを示した。
2。唾液コレクション
- 全唾液は6歯肉炎や虫歯のない明白な徴候で、全く薬を服用していない3つの健....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
我々は、多くのペプチドフラグメントは、人間の消化唾液中に存在することを発見した。これらのペプチド断片は、プロリンリッチタンパク質、アクチン、α-アミラーゼ、α1グロビン、βグロビン、histain 1、ケラチン1、ムチン7、高分子免疫グロブリン受容体、satherin、S100A9の様々なフォームからの誘導体である。未定の切断部位を有するペプチドの生産に貢献する多くの要因があるかもしれません。たとえば、いくつかのペプチド断片は、ヒト全唾液中に天然に存在するかもしれません。 C-末端-PQ多くのペプチドは、（ 表1と補足表1および2）を同定した。プロリンリッチタンパク質は、酸性、塩基性またはグリコシル化タンパク質として分類することができ、単一の領域17にクラスタ化された6つの遺伝子によってコードされている。対立遺伝子変異は、差動RNAスプライシング、タンパク質分解処理、および翻訳後修飾から17以上の30種類のプロリンリッチタンパク質の結果。分泌された後、酸性プロリンリッチPROTアインズは急速に歯面と歯垢のタンパク質分解18から19によって.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
この作品は、健康補助金の国立研究所（R01-AI067395-01、R21-R022754-01、およびR21-I58002-01）によってサポートされていました。私たちは、原稿の重要な読書のためにC.ニーマイヤーに感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| ポリエーテルスルホン膜 | ポール·コーポレーション | 30kDaのMWCO | |
| テフロンフッ素化エチレンプロピレン管 | アップチャーチ科学 | ||
| ブルーデキストラン | シグマ | ||
| ナノLCシステム | Eksigent | ||
| C18トラップカラム | アジレント | 5065-9913 | |
| LTQリニアイオントラップ型質量分析計 | サーモフィッシャー | ||
| 魔術師2 | SAGE-N ReseaRchの | ||
| アセトニトリル0.1％ギ酸 | JTベーカー | 9832から03 | LC / MSグレード |
| 水0.1％ギ酸 | JTベーカー | 9834から03 | LC / MSグレード |
参考文献
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098<....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
