可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

Summary

基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。

Abstract

表面トポロジー、基板上に成長する細胞の例は 、可変アングル全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で決定されます。細胞は透明なスライド上で培養し、均一にそれらの形質膜に分布する蛍光マーカーと共にインキュベートする。照明はエバネセント電磁界の様々な侵入深さを持つ内部全反射（TIR）の可変角度の下で平行レーザビームによって発生します。約10異なる角度で照射により蛍光画像の記録は、数ナノメートルの精度で細胞 - 基質の距離を計算することを可能にする。種々の細胞株、 例えばがん細胞と少ない悪性細胞との間の密着性の違いは、このように決定されています。また、化学的又は光線力学的治療の際の細胞接着の変化の可能性を調べることができます。超解像顕微鏡光曝露の他の方法と比較して保持されます生きている細胞の非常に小さい、無被害が発生することが予想されています。

Introduction

屈折率n ₁の媒質中を伝搬する光ビームが屈折率n ₂の第₂の媒質へのインターフェースを満たしたときに、1、全反射は、臨界角より大きい発生率Θのすべての角度で発生_ΘC =アークサイン（N ₂ / N _1）。全く反映されているにもかかわらず、入射光ビームは、I（Z）= I _{0 ^{EZ / D（Θ）}}に従ってインターフェイスから垂直距離zで指数関数的に減衰し、第二の媒体に浸透エバネセント電磁界を彷彿とさせます。で与えられるように私は（z）は、波長λにおける浸透深さに電磁場の強度に対応するとd（Θ）

D（Θ）=（λ/4π）（N ₁ ²罪^Θ2 - N ^{_2）-1 / 2}

文献^1,2に報告されているように、私は₀ は入射光の強度に対応して、私は_eが透過率T（Θ）と比n ₂ / nは₁で乗算。この光の電場ベクトルが入射面（入射と反射ビームによって張ら平面をIE）に対して垂直に偏光である場合は、この透過率は次式で与えられます。....

Protocol

1。細胞の播種およびインキュベーション

1. シード個々の細胞、 例えば U373-MGまたはU-251-MGの神経膠芽腫細胞をスライドガラス上に100細胞/ mm ²の典型的な密度にする（ 例えば RPMI-1640、10％ウシ胎児血清を添加した培地中で4872時間のためにそれらを育てると抗生物質）で37℃、5％CO _2のインキュベーターを用いた。
2. 8μM（培地中の^）4、または細胞質マーカーの濃度で60分間適用例 6-ドデカノイル-2 -ジメチルナフタレン（laurdan）、膜マーカーで細胞をインキュベートし、 例えばカルセインacetomethlyesterは、少なくとも40分間印加^4,5;5μMの^3、または光増感膜関連の濃度は、 例えば、プロトポルフィリンIXは、その前駆体5 -アミノレブリン酸（1mMの5-ALA）を用いて4時間のインキュベーションの際に誘導した。
3. 蛍光顕微鏡の前に緩衝生理食塩水（PBS）培地またはリン酸で細胞を洗浄。

2。 VA-TIRFM

1. 正立顕微鏡、 例えばツァイスAxioplanを使用しており、文献に記載されているように、照明装置によ....

Discussion

メソッドは、ナノメートルの精度で細胞 - 基質間の距離を測定するために記述されている。現在、 例えば構造化照明⁷または単一分子検出^8-10と同様に誘導放出の枯渇に基づく超解像顕微鏡の方法、（STED）顕微鏡^11は、かなりの関心が持たれている。これらの技術はいずれも、しかし、50 nm以下の軸方向の分解能を可能にしていません。また、50100 W / cm ²のかなり高い放射照度は、単一分子方法とSTED顕微鏡のために3,000人以上のW / cm ^2のために必要とされる。これは桁違いに太陽放射照度（約100mW / cm ^2）を超えて、生きた細胞になるように急速な損傷が発生する可能性があります。 VA-TIRFM実験では、しかし、放射照度は、セル^12、生体^に害なしで数分または数時間の露光時間を可能にして、20未満のMW / cm ²に限定することができるように、MULとの長期的な実験tipleエクスポージャーが十分に可能に表.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
名前	会社	タイプ	注釈
インキュベーター	ヌンク	ヌンクCellstar QM1300SVBA
層流	セーフHolten	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM +10％FCS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン	BIOCHROM		培養媒体
ガラスのオブジェクトのスライド	Marienfeld	純粋な白ガラス	使用される特殊なクリーニング手順
6-ドデカノイル-2 - ジメチルナフタレン（laurdan）	分子プローブ		蛍光マーカー（ストック溶液：エタノールさ2mm）
顕微鏡	カールツァイス	Axioplan 1
半導体レーザー	PicoQuant	ドライバのPDL 800-BとLDH 400	波長：391 nmの
シングルモード光ファイバシステム	点光源	kineFlex	平行光学系と一緒に使用
EMCCDカメラ	アンドール	DV887DC	戻る照らさカメラ