可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

Summary

基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。

Abstract

表面トポロジー、基板上に成長する細胞の例は 、可変アングル全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で決定されます。細胞は透明なスライド上で培養し、均一にそれらの形質膜に分布する蛍光マーカーと共にインキュベートする。照明はエバネセント電磁界の様々な侵入深さを持つ内部全反射（TIR）の可変角度の下で平行レーザビームによって発生します。約10異なる角度で照射により蛍光画像の記録は、数ナノメートルの精度で細胞 - 基質の距離を計算することを可能にする。種々の細胞株、 例えばがん細胞と少ない悪性細胞との間の密着性の違いは、このように決定されています。また、化学的又は光線力学的治療の際の細胞接着の変化の可能性を調べることができます。超解像顕微鏡光曝露の他の方法と比較して保持されます生きている細胞の非常に小さい、無被害が発生することが予想されています。

Introduction

屈折率n ₁の媒質中を伝搬する光ビームが屈折率n ₂の第₂の媒質へのインターフェースを満たしたときに、1、全反射は、臨界角より大きい発生率Θのすべての角度で発生_ΘC =アークサイン（N ₂ / N _1）。全く反映されているにもかかわらず、入射光ビームは、I（Z）= I _{0 ^{EZ / D（Θ）}}に従ってインターフェイスから垂直距離zで指数関数的に減衰し、第二の媒体に浸透エバネセント電磁界を彷彿とさせます。で与えられるように私は（z）は、波長λにおける浸透深さに電磁場の強度に対応するとd（Θ）

D（Θ）=（λ/4π）（N ₁ ²罪^Θ2 - N ^{_2）-1 / 2}

文献^1,2に報告されているように、私は₀ は入射光の強度に対応して、私は_eが透過率T（Θ）と比n ₂ / nは₁で乗算。この光の電場ベクトルが入射面（入射と反射ビームによって張ら平面をIE）に対して垂直に偏光である場合は、この透過率は次式で与えられます。

T（Θ）= 4 cosの^2Θ/ [1 - （N ₂ / NL _^1）2]

TIRFM測定で検出された蛍光強度は、光吸収は、サンプルのすべての層の上に統合されており、検出Ωの立体角と同様に、関連する色素の蛍光量子収率ηと乗算する必要があります。以前に³報告したように、この強度は次のように記述することができます

I _{F（Θ）=（Θ）OC（z）}での^{電子のz / D（Θ）DZ}

もし独立したfはすべての要因蛍光色素の濃度c（z）はほぼ一定であるとみなされた場合ROM入射角Θと座標zは実験定数Aの式（3）内に含まれているが、解析的に解くことができます

-いずれかのすべての座標のz≥Δ、界面からの距離Δを有する細胞の細胞質内に例えばで。この場合、積分はz =Δがために、Z =∞の結果から計算しなければならない

私は_F = A C T（Θ）はD（Θ）の^{e-Δ/ D（Θ）}

-インタフェースから距離Δに位置するT / 2とz =Δ+ T / 2、厚さtの薄い層内すなわち 、 例えば細胞膜-またはz =Δの間。この場合、蛍光強度は次のように計算できます

私は_F = A C ^{T（Θ）TE-Δ/ D（Θ）は} 、

トンはΔに比べて小さい場合。

ENT ">蛍光強度の画像は私が_Fを Θ、およびln IF可変角度_（I、F / T d）は（式4）のために記録されている場合、式（4）及び（5）細胞-基質距離からΔは、計算することができます。または_LN（I、F / T）（式5）は、これらの角度の1 / dの関数として評価されます。本稿で用いる膜マーカーlaurdan（S.以下）については評価は式5に準じて行った。

画像収集と評価が必要では、以前に報告したように³
- サンプルの上に励起光の均一な分布、
- 2層モデルの妥当性（基質と細胞質の屈折率n ₁とn ₂と、それぞれ）。原形質膜が非常に薄い場合には、保持しており、細胞外培地（セルと基板との間）の層は、入射光の波長に比べて小さい場合。

加えて、適度な開口数（通常≤0.90）顕微鏡対物レンズのは、誘電体の界面近傍界での放射の異方性に起因する輝度のばらつきを避けるために有利である。

Protocol

1。細胞の播種およびインキュベーション

1. シード個々の細胞、 例えば U373-MGまたはU-251-MGの神経膠芽腫細胞をスライドガラス上に100細胞/ mm ²の典型的な密度にする（ 例えば RPMI-1640、10％ウシ胎児血清を添加した培地中で4872時間のためにそれらを育てると抗生物質）で37℃、5％CO _2のインキュベーターを用いた。
2. 8μM（培地中の^）4、または細胞質マーカーの濃度で60分間適用例 6-ドデカノイル-2 -ジメチルナフタレン（laurdan）、膜マーカーで細胞をインキュベートし、 例えばカルセインacetomethlyesterは、少なくとも40分間印加^4,5;5μMの^3、または光増感膜関連の濃度は、 例えば、プロトポルフィリンIXは、その前駆体5 -アミノレブリン酸（1mMの5-ALA）を用いて4時間のインキュベーションの際に誘導した。
3. 蛍光顕微鏡の前に緩衝生理食塩水（PBS）培地またはリン酸で細胞を洗浄。

2。 VA-TIRFM

1. 正立顕微鏡、 例えばツァイスAxioplanを使用しており、文献に記載されているように、照明装置によって、そのコンデンサーを交換してください。半球状または光学的にオブジェクトをスライドします （ 図1を参照）に結合された半円筒形のガラスプリズムで3。
2. その試料の表面（テレセントリック瞳孔線）上の平行ビームでガラスプリズム、さらに光学部品（ 例えば凹面鏡）による撮影後、再び結果並列コリメートされたレーザービームを使用しています。電場ベクトルが入射面に垂直偏光であるように注意してください。
3. 試料面に結像されると発生率（オブジェクトの線）の可変角度で試料に照射されるコンデンサーの内部に位置調整可能なミラーを使用しています。 goniometric測定³によって決定された調整可能なミラーは、それぞれの位置は入射よく定義された角度に対応するステップモータによって駆動することができる>（商標）。
4. _ΘC = 61.3°ガラス-水移行のための固定値として臨界角を使用して調整可能なミラーの角度位置のキャリブレーションを行います。 _Θcは蛍光色素（ 例えば 1mMのフラビンモノヌクレオチド、FMN）を水に溶解させ、Θの変化に応じて可視化することができる。でミラーの位置_Θ=ΘCミラー位置決めプログラムに格納されています。
5. 温度、ゲイン、録音時間と変速速度を含むカメラのパラメータを指定します（バック点灯アンドールIXON EMCCD、DV887DC、アンドールテクノロジー、ベルファースト、イギリス^6）、設定します。
6. 適切な倍率と優先的に適度な開口数（ 例えば、40×/ 63×0.75 / 0.90水浸）の対物レンズを使用し、顕微鏡内のオブジェクトのスライドをローカライズします。ガラスプリズムと試料の光学的接触を確実にするためにイマージョンオイルを使用しています。の変動により、同一試料の蛍光画像を記録照明の角度_{（Θ≥ΘΘC}と_Cセル-ガラス界面のための64.5°に対応）。 0.5°または1°刻みで66°-74°の角度範囲が推奨されます。蛍光検出のための適切なロングパスまたはバンドパス·フィルタを使用します。

3。データ解析

1. 様々な角度Θと同様、カメラの設定（背景差別のために）、励起波長とガラス（N ₁ = 1.52）と細胞（N ₂ = 1.37）に対する屈折率で記録された画像（ 例えば 、ASCIIフォーマットで）読み込む評価プログラム（; NanoCell LabViewの）に挿入します。各パラメータセット浸透深さd（Θ）と透過率のためにTは（Θ）は自動的に計算されます。
2. 細胞 - 基質距離Δは式（5）（膜マーカー）または式（4）（細胞質マーカー）によると、不均質を有する個々の画像の評価に使用される画像を選択照明（顕E、G。ストライプ）が除外されることがあります。
3. 細胞 - 基質トポロジーの画像を計算して表示するのに適したカラーコードを選択します。 図2に示すように、個々の画素の評価プロファイルの間に、表示させることができます。これらのプロファイルは、フィットの質の指標として用いることができる。
4. 評価プロトコルを格納します。

4。代表的な結果

代表的な実験は、親切教授ヤンモレンハウアー、分子腫瘍学専攻、南デンマーク大学、オーデンセによって供給される遺伝子組み換えU251-MGの神経膠芽腫細胞を用いて行われる。それらのU251細胞のサブクローン2腫瘍抑制遺伝子でTP53またはPTENはテトオン誘導性発現系、これらの細胞が減少し腫瘍形成の可能性を発揮し、より少ない悪性とみなすことができること等を用いて過剰発現されています。抑制遺伝子のない高悪性U251-MG細胞を対照として用い、およびU251-アールMGは野生型細胞は、さらに比較のために役立つ。 （;：391 nmで、パルスエネルギー：12 PJ、繰り返し率：波長ドライバーPDL 800-B Picoquant、ベルリン、ドイツでLDH400 40 MHz）をピコ秒光パルスの準連続シリーズを発するレーザダイオードを励起光源として使用されます。

図において、活性化されたTP53腫瘍抑制遺伝子を持つとlaurdan（8μM、60分）と一緒にインキュベートU251-MGの神経膠芽腫細胞の3 TIRFM画像は、66.0°の入射角69.0°、73.0°の侵入深さに対応するために描かれているそれぞれ約140nm、75 nmおよび60 nmのエバネセント電磁界。侵入深さの蛍光の減少に伴って強度が低下（スケールを参照）、細胞のより表面的な部位（その辺で例えばフォーカルコンタクト）に由来する。細胞-基質間距離（0から600 nmの範囲のカラーコードによって図3dで可視化）に強く間のセルにわたって変化LY数ナノメートル（白黄色）と250から300ナノメートル（暗赤色）、 すなわち焦点連絡先やより大きなセル基板の距離はすぐ近くにあります。細胞-基質距離はU251-MG制御と80から100ナノメートル（黄色の典型的な値を持つ野生型細胞のためではなく、一定である同じことが、活性化抑制遺伝子PTEN（ 図4d）とU251-MGの神経膠芽腫細胞のために保持します。 図4b ）と150から200ナノメートル（橙赤色、 図4a）。

図1：正立顕微鏡のVA-TIRFM用の照明装置。ステップモータにより駆動される調整可能なミラーが±0.25°の角度分解能を可能にします。

1つのPIXについては、 図2。評価プロファイルEL（図）。 LN _[I、F / Tは（Θ）] 1 / D（Θ）の関数としてプロットすると、傾きは、細胞-基質距離Δを表しています。このスロープは、一般的に±10％程度の精度で決定されます。つの値が - 不均一な照明に起因する - のマークが付けられ、評価から除外されました。

照明の様々な角度（AC）で記録され、示されて0から600 nmの範囲で細胞-基質間の距離。laurdan（60分8μM）とのインキュベーションにより活性TP53抑制遺伝子とU251-MGの神経膠芽腫細胞の図3 TIRFM画像カラーコードにより、（d）は、励起波長：391 nmで検出：≥420 nmで、画像サイズ：210×210μmのμmの拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4に、カラーコードで示さ0から600 nmの範囲でU251-MGのglioblatoma細胞の細胞-基質間距離;（a）は野生型（b）管理;活性化抑制遺伝子TP53と（c）の細胞と、（d）活性化抑制遺伝子PTENと細胞;励起波長：391 nmで検出：≥420 nmで、画像サイズ：210×210μmのμmの拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

メソッドは、ナノメートルの精度で細胞 - 基質間の距離を測定するために記述されている。現在、 例えば構造化照明⁷または単一分子検出^8-10と同様に誘導放出の枯渇に基づく超解像顕微鏡の方法、（STED）顕微鏡^11は、かなりの関心が持たれている。これらの技術はいずれも、しかし、50 nm以下の軸方向の分解能を可能にしていません。また、50100 W / cm ²のかなり高い放射照度は、単一分子方法とSTED顕微鏡のために3,000人以上のW / cm ^2のために必要とされる。これは桁違いに太陽放射照度（約100mW / cm ^2）を超えて、生きた細胞になるように急速な損傷が発生する可能性があります。 VA-TIRFM実験では、しかし、放射照度は、セル^12、生体^に害なしで数分または数時間の露光時間を可能にして、20未満のMW / cm ²に限定することができるように、MULとの長期的な実験tipleエクスポージャーが十分に可能に表...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
名前	会社	タイプ	注釈
インキュベーター	ヌンク	ヌンクCellstar QM1300SVBA
層流	セーフHolten	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM +10％FCS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン	BIOCHROM		培養媒体
ガラスのオブジェクトのスライド	Marienfeld	純粋な白ガラス	使用される特殊なクリーニング手順
6-ドデカノイル-2 - ジメチルナフタレン（laurdan）	分子プローブ		蛍光マーカー（ストック溶液：エタノールさ2mm）
顕微鏡	カールツァイス	Axioplan 1
半導体レーザー	PicoQuant	ドライバのPDL 800-BとLDH 400	波長：391 nmの
シングルモード光ファイバシステム	点光源	kineFlex	平行光学系と一緒に使用
EMCCDカメラ	アンドール	DV887DC	戻る照らさカメラ