レーザー組織修復にローズベンガル-キトサン膜の作製と応用

サマリー

縫合糸は通常、外科手術の際に組織を修復するために必要とされている。彼らは侵襲的であり、組織に損傷を与える可能性があるしかし、そのアプリケーションが問題になることがあります。小説組織接着剤の製造、およびアプリケーションの方法はここで報告されます。この接着フィルムは、レーザー活性化され、縫合糸の使用を必要としません。

要約

光化学組織結合（PTB）は、2つの組織の縁部^1,2の間にローズベンガル（RB）のソリューションを適用することによって達成される組織修復のための縫合テクニックです。次いで、これらは、選択的にRBによって吸収されるレーザーが照射される。その結果、光化学反応は、おそらく最小限の熱産生³で、組織内のコラーゲン繊維を架橋する。本報告では、RBはレーザーで活性化される新規の組織接着剤を製造するために薄いキトサン膜に組み込まれています。キトサンおよび〜0.1重量％RBを含むに基づく接着剤フィルムは、固体レーザ（λ= 532nmで、フルエンス〜110 J / cm ^2であり 、スポットサイズは約0.5cm）により製造され、子牛腸およびラット脛骨神経に接合されている。パソコンとのインタフェースの単一列テンシオメータは、接合強度をテストするために使用されます。 RB-キトサン接着ボンドしっかりと15の強度を持つ腸±6 kPaで、（N = 30）。接着強度は、2＆に低下plusmn;レーザーを接着剤に適用されていない2キロパスカル（​​N = 30）。脛骨神経の吻合も縫合糸を使用せずに完了することができます。新規なキトサン接着剤が糸を光化学的に組織に結合し、必要としないことを試作した。

プロトコル

1。キトサン貼付製剤

1. キトサン粉末が酢酸溶液に可溶であり、酢酸（2％v / v）のストック溶液を調製するために、490ミリリットルの脱イオン水（DI-H ₂ O）に10 mlの氷酢酸を追加します。
2. 酢酸中ローズベンガル（RB）（0.01％w / v）のストック溶液の調製のために、退色を避けるためにアルミホイルで包まれたバイアル中でRBの5mgを量る。酢酸原液（1.1項で説明）の49.5ミリリットルを加えて粉末を溶解するためのDI-H ₂ Oの0.5 mlを加える。
3. キトサン溶液（1.7％w / v）の調製のために、キトサン粉末（ミディアムMW、アセチル化の85％程度）の0.85グラムの重量を量るとRB酢酸溶液50mlに追加します。コントロールは、RBなし酢酸溶液にキトサンを溶解することによって調製した。
4. キトサン混合物にマグネチックスターラーを追加し、室温で撹拌。コンポーネントの完全な溶解を確実にするために、キトサンをかき混ぜる2週間と5日間酢酸中のキトサン（コントロール）用酢酸中+ RB。キトサンが解散されたときは、溶液のpHは約2.6から〜3.9に増加します。 RBは酸性pHに難溶性であり、それは溶液のpHと溶解する拡張撹拌時間の増加が必要であることに注意してください。
5. 1時間3270 xgで遠心し、ソリューションを使用して上清を回収し、例えば、無菌の10mlシリンジ。不純物の沈殿を乱さないようにしてください。このステップの間、溶液は肉眼で見える不純物、不溶物から洗浄される。
6. 無菌の注射器を使用してフラットperpexスラブ上（遠心分離）キトサン溶液を注入します。乾燥したフィルムの厚さは、溶液の調剤量と溶液が広がっているその上に表面積との比に依存する。ソリューションは気泡がないと均等にスラブの上に広げていることを確認します。 〜13μmの厚さの薄膜を得るために、12 cm ^2の表面の上に〜1mlの溶液を注入面積（寸法は〜3×4センチ、 図1A）。
7. 溶液の退色を避けるために、例えばアルミ箔製のスクリーンを持つ風防スラブを、カバーしています。十分な換気が画面の下に溶液を乾燥することが保証されていることを確認します。
8. 得られたフィルムは水に不溶であり、肉眼的に膨潤しないまで室温（25℃）及び圧力（1気圧）で乾燥するソリューションを残す。これは一般的に2週間で達成される。
9. 慎重に薄くて平らなへらを使用してフィルムをはずす：これらのフィルムは、簡単にそれらを損傷することなく、風防スラブに剥離することができる。
10. マイクロメーターを用いてフィルムの厚さを測定します。
11. きれいな鋭いはさみで短冊で接着剤をカットし、その平坦な形状を維持するために滅菌したガラススライドの間に配置します。遮光のためにアルミホイルでスライドを包み、室温で保管してください。または "キトサンadhes"接着バラ "として、RBの有無にかかわらず、接着剤のラベルを付けますそれぞれ "IVE。
12. バラの接着フィルムをエタノール（90％）またはガンマ線（24時間0.1 KGy / h）で^4,5とを用いて滅菌することができる。

2。接着剤光減衰

1. 石英キュベット内のバラ接着剤を固定します。
2. デュアルビーム分光光度計^4を使用^して 800nm ​​の- 400の範囲で、その減衰スペクトルを記録します。
3. 次のように接着剤の減衰長を計算し、ベールの法則の妥当性を仮定すると、I = I ₀の^e-AXここで私は_0は入射ビーム強度は、1 /減衰長であり、xは膜厚である。
4. キトサン接着剤の2.1から2.3にコントロールとして機能するように手順を繰り返します。

3 体外アプリケーションで次の操作を行います 。小腸におけるレーザーティッシュボンディング

1. 収穫ウシ腸直後は-80℃で、動物安楽死と℃で保存
2. 使用前に、霜と水和物TI10分間のDI-H ₂ O中に浸漬してssue。
3. 手術用顕微鏡（×10）の下で＃10ブレードを使用してセクション（2×1cm）をに組織を二分。 DI-H _{2 O}を使用してセクションの潤いを保つ
4. （エンドツーエンド）近くに一緒に切開の切り株を持参してください。綿のヒントを使用して表面から余分な水分を拭き取ります。
5. 腸（ 図2）と完全に接触を確保microforcepsと漿膜層に切開を横切っバラの粘着ストリップ（10×6 mm）を配置します。
6. バラの接着剤の組織の癒着は、マルチモード光ファイバ（コア径200μm）を⁴に結合されているダイオード励起固体レーザによって活性化される。
7. 180 mWにレーザーのパワーレベルを設定し、 表1に記載されたパラメータを使用して〜5mmのビームスポットサイズで〜6分、のための接着剤を照射します。各スポットは、隣接するスポットにビームを移動する前に、約5秒間照射されていることを確実に接着剤をスポット照射します。 T彼の手順では、レーザービームが接着剤を数回の全体の表面積をスキャンすることを保証します。
8. 組織接着強度を評価するために、機械的なグリップを使用して校正された単一の列テンシオメータ（インストロン、MA、USA）に試料をクランプします。 ^4つの独立した二つの組織の切り株まで22ミリメートル/分でグリップを移動します。
9. ステップ3.5で説明されるように組織上のバラの接着剤を置きます。試料に照射し、手順3.8で説明したように、組織の接着強度を測定しないでください。このサンプルでは、​​コントロールとして機能します。

4 in vivo用途で次の操作を行います 。脛骨神経の吻合

1. O /イソフルラン₂混合物（以後誘導中に^{4％、2％）5}と落ち着いたWistarラット。皮下術中鎮痛作用を提供し、できるだけ痛みや不快感を軽減するためにBuprenexを（0.03 mg / kg）を注入します。
2. 以下の外科的処置は、手術用顕微鏡（×10）の下で行われるべきである。斜めの肌を作る右大腿部の背外側部で長く臀筋^2を介して筋肉分割アプローチで脛骨神経を露出さ約3cm切開。
3. 部分的に分析し、ストレートマイクロ剪刀を用いて脛骨神経の外膜をトリミングして、滅菌ガーゼや綿のヒントと余分な水分を吸収する。
4. マイクロはさみで脛骨神経を切断。
5. マイクロ鉗子を用いて脛骨神経の下に位置無菌キトサンストリップ（寸法は5×4 mm）です。
6. バラ粘着ストリップ上のマイクロピンセットで近似神経切り株エンドツーエンド。
7. ストリップが完全にストリップのレーザー照射時に神経の回転に伴って、支援することができます襟を形成する神経にも準拠しています。
8. ）ステップ3.6で説明されるようにレーザーでバラの接着剤を活性化）と3.7。
9. 作動神経の襟から冗長バラ接着剤をトリムします。
10. 5 3から0縫合糸⁵と筋肉と皮膚を閉じます。
11. 必要に応じて標準的な術後の回復手順は、裂開や膿形成や鎮痛剤投与のための日常点検を含む従うべきである。

5。代表的な結果

得られたフィルムは明るいカラーでバラ薄く、滑らかな表面（ 図1）を持っている。彼らはまた、柔軟であり、涙や他の明らかな損傷（ 図1B）を発生させることなく小径のチューブにロールバックすることができます。バラの接着剤は、530および562 nmの2つの吸収ピークを有し、緑のレーザーはこのように強力に接着剤で吸収し、532nmで対応する減衰長は〜12μmで（ 図3）である。これとは対照的に、RBなしキトサンフィルムはおそらく、弱く散乱によるレーザー（1 /〜162μm）を減衰させる。それはRBの有意な凝集が映画の中で発生していないことをスペクトルプロットから表示されます。

しっかりと接着結合をバラ0.9障害発生時の典型的な最大負荷を達成するため、レーザー照射（ 図2）±0.4（N = 30）の時に腸へ。接着強度は、接着表面積、すなわち、15で割った最大荷重±6キロパスカル（​​n = 30）のように推定された。非照射バラ接着剤は組織に結合して有意に少ない（2±2kPaと、n = 30の、対応のないt-検定、p <10 ^6）。脛骨神経の生体内吻合は正常に緑色のレーザーと一緒にバラの接着剤の塗布及び接合後に達成された。術後一週間、運営神経が継続していたと修理の強度は17歳±9キロパスカル（​​n = 10）であった。

図1。）RB-キトサン溶液は、フラットパースペックススラブ（スラブ厚さ約5 mm）の上にキャストされています。方眼紙は、乾燥キャストステップを容易にするスラブの下に配置されています。水不溶性FILMは2週間鋳造後に得られる。 B）はバラ接着剤は柔軟性があり、小さなシリンダーにロールバックすることができます。

図2：バラの接着剤は、レーザー照射後の子牛の腸に接着されている。均一照射は組織ボンディング時のRB接着剤に適用されますが選択されたスポットは、接着剤にレーザーの光漂白効果を説明するために、この絵に示されている。

図3：バラの接着剤の吸収スペクトルは、（任意の単位）530および562 nmの2つのピークを示す。緑色レーザー（λ= 532 nm）をこのように強くレーザー露光時の接着剤によって吸収される。 RBなしキトサン接着が不十分なレーザー光を吸収。

	N	面積（mm 2）チョン·	消費電力（W）	時間（s）	フルエンス（J / cm 2）を	I（W / cm 2）を	最大負荷/エリア（KPA）
接着剤+レーザー	30	60±10	0.18±0.03	365±5	〜110	〜0.9	15±1
接着剤	30	60±10	NA	NA	NA	NA	2±2

表1。伝説。 nはサンプル番号、エリア、バラの接着剤の表面積（±最大誤差を意味する）、パワー、レーザパワー（±最大誤差を意味する）、時間、照射時間（±最大誤差を意味する）、フルエンス、平均レーザフルエンス、私、推定IRRadiance、最大負荷/エリア、接着表面積で割った修復組織の破壊時の最大荷重（平均±SE）。

ディスカッション

酸性pHにおけるRBの溶解が延長キトサン溶液の攪拌を要求している接着剤の製造は、シンプルな乾式キャスト法に基づいていました。それは水に不溶性の膜となるまで溶液が乾燥させることが重要です。重量含水率は乾燥膜^6〜10％であるとき、これは起こります。不溶性のフィルムは、通常、温度と圧力の標準条件（〜25℃、約1気圧）で2週間乾燥キャスティング後に得られる。それは隣接組織への接着剤からRBの拡散が、レーザーは、組織の界面に効率的に光活性化することができていることが観察されたが、組織の接着のメカニズムは、まだ明らかではない。これは、一重項酸素を生成するRBの能力は、光照射によって、そのアミノ基を介して^、7,8架橋組織コラーゲンとキトサンの役割を果たすかもしれないと推測することができる。バラの接着剤に関する最近の研究では、最高温度がTISの間に達成することも示されたSUE-接着は光化学過程⁴の仮説を支持する、〜32℃であった。組織修復のための他の縫合技術は現在いくつかの研究グループによって検討されている。例えばレーザー溶接組織（LTW）が正常ピーニら ^9<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
ローズベンガル	シグマアルドリッチ	632-69-9
キトサン（ミディアムMW）	シグマアルドリッチ	10318AJ
氷酢酸	シグマアルドリッチ	08050051	DI水で2％v / vの
マグネチックスターラー	Heidolph	MR特ミックスS
遠心	ベックマン·コールター	アレグラX-12R
分光光度計	バリアン	ケーリー4000紫外可視
レーザー	CNIレーザー	MGL-532
マイクロメータ	ミツトヨ	シリーズ227
外科用顕微鏡	ツァイス	OPMI