腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

Summary

間質液の流れが固形腫瘍で上昇し、腫瘍細胞の浸潤を調節することができる。ここでは、マトリックス中に埋め込まれた細胞に間質液の流れを適用し、細胞浸潤に及ぼす影響を測定する手法を説明します。このテクニックは簡単に他のシステムを研究するために適応させることができます。

Abstract

ほとんどの固形腫瘍の増殖と進行は、癌細胞と間質に関連した腫瘍微小環境¹でシグナルへの応答の最初の変換に依存しています。以前に、腫瘍の微小環境の研究は主に腫瘍間質相互作用の^1から2に焦点を当てている。しかし、腫瘍の微小環境にも影響をよくわかっていないまま生物物理学的勢力が多数含まれています。これらの力は、遺伝子発現の変化、細胞分裂、分化、浸潤³につながる腫瘍増殖の生体力学的な結果である。行列の密度^4、剛性^5-6、および構造^6-7、間質液圧^8、間質液の流れ^8はすべての癌の進行中に変更されています。

特に間質液の流れが正常組織^8-10に比べ腫瘍で高くなっています。推定間質液のFLフロー速度を測定し、腫瘍の大きさと分化^9、11に応じて、0.1から3ミクロンs ^-1の範囲内であることがわかった。これは、腫瘍血管新生と血管透過性の増大¹²に起因する間質液圧の上昇によるものです。間質液の流れが癌細胞の浸潤^13-14、血管の線維芽細胞と平滑筋細胞^15を増加させることが示されている。この侵略は3-D ¹⁶でセルの周囲に作成またはマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現^15、ケモカインの分泌と細胞接着分子の発現^17日増加した自己走勾配に起因することがあります。しかし、細胞は流体の流れを感知するメカニズムはよく理解されていません。腫瘍細胞の挙動を変更することに加え、間質液の流れが腫瘍微小環境内の他の細胞の活性を調節する。それは（）腫瘍促進myofibrに線維芽細胞の分化を駆動するに関連付けられていますoblasts ^18、（b）の抗原とリンパ節^19、及び（c）変調リンパ内皮細胞の形態²⁰に他の可溶性因子の輸送。

ここで紹介する手法は、in vitroでの細胞の間質液の流れを課し、浸潤（ 図1）に及ぼす影響を定量化します。このメソッドは、間質と癌細胞の浸潤^13-15、17日に流体の流れの効果を測定するために、複数の研究では公開されています。マトリックス組成物、細胞型、細胞濃度を変えることによって、このメソッドは、他の病気や浸潤、分化、増殖、遺伝子発現などの細胞プロセスの間の流れの影響を研究する生理学的システムに適用することができます。

Protocol

1。アッセイセットアップ

1. 4℃（約2時間）で氷の上でマトリゲルの小アリコート（<500μl）を解凍します。
2. ゲルのレシピ（下の表に例のボリュームを参照してください）​​準備：10倍PBS（総量で1×）、1N水酸化ナトリウム（追加されたコラーゲンの0.023ボリュームと同等、またはコラーゲンの製造業者の推奨に従って、必要に応じて）、マトリゲルとコラーゲンにIを入力します。に1 mg / mlとそれぞれ1.3 mg / mlの最終濃度（他のマトリックス製剤は細胞の種類や実験に応じて使用されるかもしれません）。

例のゲルのレシピ

コンポーネント	ストック濃度	最終濃度	ボリュームを加える
10×PBS	10X	1X	0.090ミリリットル
滅菌水			0.346ミリリットル
1NのNaOH

Discussion

ここでは、細胞培養インサート内の3-Dマトリックス中に埋め込まれた細胞を用いて、腫瘍細胞の浸潤の間の流れの影響を定量化する方法を説明してきました。これと同様の方法は、細胞の種類^13-15、17のさまざまな格子フローの効果を調べるために使用されている。我々のアプローチは、部分的にI型コラーゲンおよび上皮組織と周囲の間質^21から22の基底膜に見られる蛋白質を含むマトリゲルを使用することによって腫瘍の行列微小環境を模倣しています。このシステムは、in vitroで ^23から24 の間質液の流れを研究するために使用されているほとんどのマイクロ流体デバイスをより効果的な、単純な、そしてより多くのコストアップを設定することは比較的簡単です。それは、ポンプや特殊な機器を必要とし、同時にテストする、複数の条件を可能にすることはありません。さらに、測定は一般的に侵入し、マイグレーをテストするために使用される既存のBoydenチャンバーアッセイのものと同等である癌細胞のる。

細胞型とマトリックスの組成.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
コラーゲン（ラットテール）	BD	354236	無菌に保つ
Millicellセルカルチャーインサート	ミリポア	PI8P01250	8μmの孔径、ポリカーボネート膜
マトリゲル	BD	354234	無菌に保つ
PBS	シグマアルドリッチ	100M-8202	洗浄ステップのためにゲル溶液、1xを調製するための10倍
水酸化ナトリウム、1.0Nソリューション	シグマアルドリッチ	S2770	無菌に保つ
DMEM 1X	CellGro	10から013-CV	無菌に保つ
ウシ胎児血清	アトランタバイオ	511150	無菌に保つ
ペニシリンストレプトマイシン	CellGro	30002CI	無菌に保つ
トリトンX-100	シグマアルドリッチ	X100-500ミリリットル	PBS中の0.5％
パラホルムアルデヒド	フィッシャー·サイエンティフィック	04042-500	PBS中4％
脱イオン水			無菌に保つ
4 ',6-diaminido -2 - フェニルインドール（DAPI）	MPのバイオメディカル	0215757401	1 mg / mlのストック溶液
マウントソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	TA-030-FM
トリプシン-EDTA	CellGro	25から052-CI	無菌に保つ