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10.3791/4166

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2012年8月15日

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1Infectious Disease Research Center, CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada

この記事について

サマリー

我々は開発した in vitroでマラリア、HIV-1の共感染モデル熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）ヒトの第一次単球由来マクロファージにおけるHIV-1複製サイクルで。この汎用性の高いシステムを簡単​​にHIV-1感染に感受性で他の主要な細胞型に適合させることができます。

要約

熱帯熱マラリア原虫 、マラリアの最悪の形態の病原体、およびヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）は、毎年1〜4万人が死亡の合計責任がある、世界的に最も重要な健康問題の一つです。特に開発途上地域、サハラ以南のアフリカでの大規模な重複のために、マラリア、HIV-1との共感染が一般的ですが、2つの疾患の間の相互作用は十分に理解されています。疫学的な報告書は、マラリア感染は一過性HIV-1複製を高めると共感染した個体2,3のHIV-1ウイルス量を増加させることが示唆されている。このウイルス血症は、抗マラリア薬による治療後数週間にわたって高いままなので、この現象は疾患の進行および伝送に影響を及ぼす可能性があります。

これらの観​​察の背後にある細胞の免疫学的メカニズムは、ほとんど研究されていない。 in vitro試験investig のいくつかのHIV-1にマラリアの影響をatingは、水溶性のマラリア抗原への曝露が免疫細胞にHIV-1感染と再活性化を高めることができることを実証した。しかし、これらの研究は、Pの全細胞抽出物を使用熱帯熱マラリア原虫シゾント段階の寄生虫および末梢血単核細胞（PBMC）、マラリア成分（s）が観測された効果とどのようなターゲット·ホスト細胞は4,5であったために責任があった解読が困難となっています。最近の仕事はマラリア色素の未熟単球由来樹状細胞の暴露を実証してきましたhemozoinは、CD4 + T細胞の6,7にHIV-1を転送する能力を増加したが、それはマクロファージ8のHIV-1感染を減少させている。この複雑なプロセス、マラリア原虫と異なった、関連するヒト初代細胞集団におけるHIV-1の間の相互作用の体系的な分析に光を当てるために決定的に必要とされる。

Hの影響を調査するためのいくつかのテクニック微生物の貪食におけるIV-1とHIV-1複製にそのような病原体の効果が記載されている。ここではPの影響を調査する手法を提案ヒトの第一次単球由来マクロファージにおけるHIV-1の複製に熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球。感染したマクロファージによって放出ウイルス量への影響は測定することによって決定される一方、HIV-1転写/翻訳のイベントの寄生虫暴露の影響は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、env遺伝子に置き換えられていた単一サイクルシュードウイルスを使用して監視されてい細胞上清中のELISAによるp24のHIV-1キャプシドタンパク質。

プロトコル

注：HIV-1と熱帯熱マラリア原虫を用いた実験は、適切なバイオセーフティレベルの研究室で実行する必要があります（寄生虫のBSL2、BSL3とHIV-1と共感染症）と潜在的に感染したヒト血液を使用する場合は、特別な予防措置がとられている必要があります。

1。末梢血単核細胞（PBMC）精製（8および9に基づく）

  1. 抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、クエン酸デキストロースまたはクエン酸リン酸デキストロース）で処理した健康なドナー（500ミリリットル）から新鮮なヒト血液から始まります。 PBMCを精製単離する際にエンドトキシンフリーの試薬を使用して、プロトコルの残りの部分。
  2. チューブを含む血液バッグを、消毒、70％エタノールで、T150フラスコに血液を移す慎重にチューブをカットします。
  3. 50 mlコニカルチューブあたり15ミリリットルリンパ球分離培地（フィコール）（フィコールが室温に達していることを確認してください）​​で16のチューブを準備します。上に新鮮な血液を注意深く層30ミリリットル。
  4. 20℃で30分間途切れるとCを400 xgで遠心します。
  5. 遠心操作中に、チューブごと室温ハンクス平衡塩溶液（HBSS）25mlで8×50 mlコニカルチューブを準備します。
  6. 慎重に HBSS（チューブあたりプール2セルリング）を含む50 mlチューブへのインタフェースで曇ったセルリング（PBMCを含む）に転送します。 HBSSで50mlにボリュームを完了します。
  7. 20℃、15分で休憩したC、150 xgで遠心します。
  8. 曇ったセルリングの遠心分離の間に、フィコール、ステップ、50 mlコニカルチューブを埋めるためにプール血漿から黄色の上位層を収集します。 ℃で30分間、1,800×gで10分間スピン56で50 mlチューブを加熱することによって、プラズマ中で補完する不活性化する。上清（後の手順では培地サプリメントとして使用することができます含まれている希釈自家血漿）を保持します。
  9. 慎重に上清とresuspenを削除50 mlチューブごとにHBSS、プール2ペレットを25mlのステップ1.7からdの細胞ペレット。 20℃で8分間300×gで遠心
  10. 慎重に上清を除去し、10mlのHBSSと1つの50 mlチューブにプールにペレットを再懸濁します。
  11. アリコートを取り、死亡率を評価し、PBMCをカウントするためにトリパンブルー排除を実行します。
  12. HBSS、300×gでスピン10分で50mlへの完全なボリューム。上清を除去し、5×10 6細胞/ ml（1つは血液500ml中400から500×10 6 PBMCの周りに取得する必要があります）で、RPMI 1640で細胞を再懸濁します。

2。単球由来マクロファージ（MDM）分化（8および9に基づく）

  1. RPMI 1640（25ミリリットル/皿）と15cmの皿に種子約1.25×10 8 PBMC。
  2. 細胞は5％CO 2雰囲気下で37℃で1〜2時間のために付着しましょう。
  3. 新しいフラスコに、非付着細胞を移し、15 mlのエンドトキシンフリーのPBS倍（5でプレートを洗浄分、300×g）で。付着した細胞が分離した単球である。
  4. 新たに単離した単球はMDMに分化できるようにするには、5％の自家血漿（ステップ1.8から）を補充したRPMI 1640培地20mlを追加します。ヒト組換えマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、25 ng / ml）およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（PS、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン）を追加します。 2日間インキュベートし、培地を変更し、37 5％°C CO 2雰囲気下で2〜3余分な日をインキュベートします。
  5. 古い培地を除去し、エンドトキシンフリーのPBS回で洗浄し、PBSで穏やかに追加し、直ちに吸引除去する。完全に分化したMDMをデタッチするには、5％COで37℃で15〜20分間〜7ミリリットルAccutase（Accutase、プラスチック製の皿からの細胞の剥離を可能にするプロテアーゼとコラゲナーゼ活性の市販のミックス）で細胞を治療する2雰囲気下、中間時にそっと岩。
  6. （細胞を保護するために、しばらく各プレートに3〜5ミリリットル自家血漿（ステップ1.8から）を追加）こする。
  7. 静かに培地50 mlチューブ内のすべての時間と転送/プールでのセルをカバーすることを確認して細胞をこすり取る。
  8. できるだけ多くの細胞を回収し、エンドトキシンフリーのPBSでプレートを洗浄します。
  9. 200 xgで5分間遠心、上清を捨てる。
  10. 5ミリリットルMDM培地でペレットを再懸濁し、カウント細胞（MDMは、通常、全体のPBMC 2〜8％）を得た（RPMI 1640には10％補体不活化ウシ胎児血清（iFBS）、PS、25mMのHEPESを添加した）。注：MDMのアリコートをフローサイトメトリーにより細胞集団の純度を評価するために、この手順で実行されているかもしれません。通常の99％がMDM急行CD14を得た。
  11. 24ウェルプレートにウェルあたりMDM培地600μlの1×10 5シードMDM。
  12. 感染する前に、5％CO 2雰囲気下で37℃で一晩インキュベートします。

3。 HIV-1ウイルス株の生産と定量

  1. HEK293T細胞folloのリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてウイルス株を生成する翼ティンらのプロトコル10。
  2. R pHCMV-Gの+および10μg、またはNL4.3 リュック 15μgの-のいずれかNL4.3 リュック + Envの20μgのルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を含む単一サイクルウイルス、同時トランスフェクションHEK293T細胞を得るために+ ENV - R +とpJRFL envの15μgの。 +制御蛋白質欠損ウイルスを生成するためにR - NL4.3 リュック + Envの30μgを使用しています。完全に複製ウイルスについては、NL4.3Bal envの30μgを使用しています。ベクトルpHCMV-GとpJRFL envは、それぞれ、水疱性口内炎ウイルス（VSV-G）のとCXCR5指向性HIV-1（NL4.3Bal ENVとは異なる）のエンベロープ糖タンパク質をエンコードします。プラスミドの追加情報については、8から入手することができます。プラスミドは、NIHのエイズ研究とリファレンス·プログラム（NIAID、NIH）を介して取得することができます。
  3. HIV-1 p24のキャプシドタンパク質11のELISAを使用して、すべてのウイルス株を定量化すると、使用する前にそれらの感染の可能性を確認します。我々は、TZM-BLインジケータセル12を使用して私たちのウイルス株の感染性を評価します。

4。 熱帯熱マラリア原虫の寄生虫の文化（13に基づく）

寄生虫の4.1一般的な文化とメンテナンス

  1. P.を維持する 0.5％（w / v）のAlbumax II、25μg/ mlのゲンタマイシンを添加したRPMI 1640で4％のヘマトクリット値（25mMのHEPESおよび25mM NaHCO 3でバッファリング）でヒト赤血球（血液グループO +）で熱帯熱マラリア原虫 3D7無性段階の原虫と37℃で370μMのヒポキサン​​チン窒素の1％酸素/ 5％二酸化炭素の混合ガスに°C。
  2. 寄生虫は、文化の薄層塗抹標本を作り、15％ギムザ液で染色することにより監視することができます。
  3. 寄生虫は、コントロールとして使用すると、常に同じ条件で感染赤血球（uRBC）培養皿を維持します。
    後期parasitを取得するにはES（栄養型/初期のシゾント）は、次のように寄生虫を同期させます。

4.2パラサイト同期

  1. 午前中に、寄生虫の文化を収穫し、300 xgで5分を回転させ、上清を捨てる。
  2. 5％（w / v）の37℃でD-ソルビトールとインキュベート5分℃で5パック細胞量のペレットを再懸濁し
  3. 300×gで5分間回転、30 mlの培養液上清、ペレットを再懸濁しを破棄し、インキュベーターに戻す。
  4. 約8時間後に、しっかりと同期して寄生虫を得るためには、手順4.2.3から4.2.1までを繰り返します。後期原虫（栄養型/初期のシゾント）は、その後の実験を実行するには、次の朝に収穫することができます。精製前に、ライフサイクルの段階を確認するために、ギムザ染色を行います。

4.3 熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（IRBC）精製

  1. 70％エタノールとpでVarioMacsセパレータ（スタンド磁石）を殺菌する生物学的なボンネットの下にレース。
  2. CSカラムの底部に三方活栓を修正します。
  3. ミルテニー特殊なカッター針プラスチックのプロテクターの端をカットして栓の底に針を固定してください。
  4. 慎重に磁石に列をロックします。
  5. 徐々にコックの左側にあるねじキットで囲まれたシリンジを用いて、MDM培地の10mlを注入することによって、列内のすべての気泡を除去します。
  6. 〜20ミリリットルMDM培地でカラムを洗浄します。
  7. 培養プレートから収穫RBC、10ミリリットルのMDM培地（300×gで、5分）で1回洗浄し、12ミリリットルMDM培地でRBCペレットを再懸濁します。徐々に列に追加します（栄養型またはシゾント段階で寄生虫を含む唯一の感染赤血球がhemozoin結晶の存在に起因する磁場によって保持される）を介して懸濁液の流れをみましょう。
  8. 20 mlの培地で1回洗浄し、カラムの上に白いディスクに到達したときに液体の流れを停止します。
  9. 12ミリリットルのMDM培地でクリーンな滅菌チューブに磁石と溶出IRBCから列を削除します。
  10. 塗抹標本は、回収IRBCのアリコートとライフサイクルの段階を確認するために、ギムザ染色を行います。
  11. haemocytometer（絶縁されたRBCが100％IRBCです）を使用して回復IRBCをカウントします。
  12. 細胞をペレット化（300×gで、5分間）、上清を捨て、500μlの新鮮なAB +ヒト血清（オプソニンステップ14）で細胞を処理します。
  13. 5％CO 2雰囲気中で37℃で30分間インキュベートします。
  14. 10ミリリットルMDM培地（300×g、5分）で1回洗浄し、所望の濃度にIRBC再懸濁します。通常、10％の寄生虫血症15cmの培養皿は約〜0.5×10 8しっかり同期IRBCを提供します。

5。 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のMDMの暴露

  1. 75:1のMDM：uRBCまたはIRBCにMDMを公開するには、細胞がuRBC / IRBCの比を得るためには、MDM培地に再懸濁されている必要があります。以前にMDMを含む調製24ウェルプレートは、各ウェルに適切なRBC懸濁液のボリュームを追加します。三重のすべての実験を行う。
  2. 5％CO 2雰囲気中で37℃で4時間共培養をインキュベートします。
  3. エンドトキシンフリーのPBSで3回、600μlで細胞を洗浄し、PBSで穏やかを追加し、直ちに吸引除去する。
  4. 残りの赤血球を溶解するために、20秒と吸引のために氷冷滅菌水200μlを添加することにより、ウェルを洗浄する。
  5. 600μlのMDM培地を追加し、5％CO 2雰囲気中で37℃で24時間インキュベートする。

6。完全に複製、HIV-1とMDMの感染

  1. P.の効果を評価するために、 MDMのHIV-1複製に熱帯熱マラリア原虫は 、 図1A、適切なウェルにNL4.3Bal ENVウイルスのp24 10ngの（MDM培地300μLで）に概説スキームに従って、追加します。対照ウェルでのみMDM培地を追加する。
  2. 5に37℃で2時間インキュベートする％2大気のCO。
  3. エンドトキシンフリーのPBSで3回細胞を洗浄し、PBSで穏やかを追加し、直ちに吸引除去する。ウェルあたり新鮮なMDM培地600μlを添加します。
  4. 5％CO 2雰囲気中で37℃でインキュベートします。
  5. 3日目、6、9時と12ウイルス感染の開始後、各上澄みの収穫を200μl、その後新鮮なMDM培地200μlを追加します。フォルタンら 10以下のELISA法による主要なHIV-1キャプシドP24タンパク質の定量のために-20℃で収穫された上清を保持します。

7。シングル·サイクルウイルスエンコーディングルシフェラーゼとMDMの感染

  1. R +（ - MDMのHIV-1遺伝子発現に及ぼす寄生虫の影響を決定するために、10 ngのP24（MDM培地300μl中）NL4.3 リュック + Envのいずれかの、 図1Bで説明されている方式に従って、追加VSV-G）、NL4.3 リュック + ENV - R +（JRFL ENV）またはNL4.3 リュック +ENV - R +対応するウェルのウイルス。
  2. 5％CO 2雰囲気中で37℃で2時間インキュベートします。
  3. エンドトキシンフリーのPBSで3回、600μlで細胞を洗浄し、PBSで穏やかを追加し、直ちに吸引除去する。ウェルあたり新鮮なMDM培地600μlを添加します。
  4. 5％CO 2雰囲気中で37℃でインキュベートします。
  5. 培地で72時間以下の感染を除去し、溶解緩衝液1X（ルシフェラーゼアッセイキットに付属）の200μlを追加します。細胞は穏やかに振盪しながら室温で溶解してみましょう。 -20℃で保存
  6. プレートを解凍し、96ウェルルミノメータープレートにライセート40μlを移し、ルシフェラーゼ基質を100μl（ルシフェラーゼアッセイキットに付属）を追加し、メーカーの指示に従って、ルミノメーターでルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ）活性を測定します。

8。代表的な結果

私たちの共感染モデルを用いて、我々はそのexposurを表示P.の電子MDMへの熱帯熱マラリアは 、HIV-1感染症に対する感受性を減少させます。確かに、有意な減少（P <0.05; 2ウェイANOVA、12日目）のような上清中のHIV-1 p24のキャプシドタンパク質で測定したウイルス粒子のリリースでは、寄生虫（ 図2A）で前処理したMDMにおいて観察される。この観察は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするウイルスに感染した細胞で確認されています。外因性のVSV-GまたはHIV-1糖タンパク質のいずれかを保有するこのようなウイルスとMDMの感染は、P.に曝露した細胞で有意（p <0.05、スチューデントのt検定）未満のルシフェラーゼ生産につながる熱帯熱マラリア原虫 （ 図2B）。これは、VSV-Gシュードタイプウイルスは、そのJRFLenv対応するよりもはるかにルシフェラーゼ活性をもたらしたことは注目に値するが、これはVSV-Gシュード粒子15の大きい感染効率によるものです。寄生虫博覧会することは、ウイルスの両方のタイプのMDMへの影響に与えられ、これは、ウイルス遺伝子の元にいくつかのステップに影響を与えることを示唆している下り坂（ 図2B）。その細胞の生存率が観察さ阻害は特異的細胞の死亡によるものではないことを示す（データは示さず）IRBCにMDM博覧会の影響を受けなかった言及することも重要です。

figure-protocol-1
図1。完全に複製ウイルス感染のMDM A）プレートスキームモック：非感染細胞。 uRBC：感染赤血球に暴露された細胞。 IRBC： 熱帯熱マラリア原虫感染赤血球に暴露された細胞。バル：NL4.3Bal ENVバル/ uRBCに感染した細胞：細胞はuRBCにさらされるとNL4.3Bal ENVバル/ IRBCに感染：MDM感染の IRBCとNL4.3Bal ENV Bの感染に曝露した細胞）プレート方式と単一サイクルルシフェラーゼをコードするウイルスモック：非感染細胞。 uRBC：感染赤血球に暴露された細胞。 IRBC： 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の-iに曝露した細胞nfected赤血球。 Δenv：NL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R + JRFL：NL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（JRFL ENV）。 VSV-G：NL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（VSV-G）Δenv/ uRBC：細胞uRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの-R +Δenv/ IRBCに感染：細胞はIRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した- R + JRFL / uRBC：uRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（JRFL ENV）。 JRFL / IRBC：IRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（JRFL ENV）。 vsv-g/uRBC：uRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した細胞- R +（VSV-G）vsv-g/iRBC。細胞はIRBCにさらされるとNL4.3 リュック + Envの感染した- R + （VSV-G）。

figure-protocol-2
図2。 。4時間MDM）と広範囲に洗浄：A）MDM MDM のHIV-1ウイルスの生産に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の影響を比75:1（uRBC / IRBCでuRBCまたはIRBCにさらされた。細胞は2時間P24 NL4.3Bal envの10ngに感染させた。ウイルス産生は、初期のウイルス感染後の異なる時点での無細胞上清中のHIV-1 p24抗原のELISAによりモニターした。代表的な実験が示されているB）MDM MDM のHIV-1の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の効果は、ウイルス転写が比75:1（uRBC / IRBCでuRBCまたはIRBCに感染していた：MDM）。 リュック + EnvのR +（JRFL ENV）またはNL4.3 - - R +、NL4.3 リュック + ENV -細胞は、単一サイクルのウイルスのp24の10ng（いずれNL4.3 リュック + Envのに感染していたR +（VSV- g））になります。ルシフェラーゼ発現は72時間以下の初期のウイルス感染を細胞ライセートで評価した。代表的な実験が示されています。

ディスカッション

我々は、ウイルス遺伝子の発現または単球由来マクロファージにおける子孫ウイルスの生産と複製のどちらかを分析することにより、HIV-1ウイルスのサイクル、すなわち上のマラリア原虫の影響を分析するためにここで2つの異なるアプローチを説明しました。同様のアプローチは、他のHIV-1寄生虫の共感染16のために使用されている。しかし、これらの新しいデータはマラリア、HIV-1の共感染の調査では一歩前進です。 実際 、Diou ら 8は、HIV-1複製に、hemozoinの効果ではなく、ライブの寄生虫を研究した。我々の結果と一致して、彼らはhemozoinはウイルスMDMによる生産ではなく、MDMSを阻害すること自体が十分であったことを観察した。

記載された実験レイアウトを使用して、我々は観察されたP.熱帯熱マラリア原虫はマクロファージにおけるHIV-1複製サイクルを明確に有害な効果を発揮する：ウイルス産生の有意な阻害は、マクロファージの寄生虫に事前に暴露さで観察される（Figur電子2A）およびウイルス転写における寄生虫の具体的な影響は、図2Bに示されています。しかし、我々は、ウイルスの侵入または融合（decapsidation）上、またはそのようなタンパク質合成またはウイルス粒子のアセンブリおよび出芽などのポスト統合メカニズムに寄生虫の任意の追加の影響を除外することはできません。さらに、寄生虫、ウイルスと同時にまたは次のMDM感染症のいずれかで追加された場合、HIV-1複製に異なる影響が得られるであろうことが可能である。

私たちは 、in vitro共感染モデルでのHIV-1 / Pの詳細な調査を実行する強力なツールを提供しています宿主細胞内での熱帯熱マラリア原虫の相互作用。例えば、宿主細胞ゲノムへのウイルスretrotranscriptionの具体的な手順とウイルスゲノムの統合を標的とし、定量化できるような定量的リアルタイムPCRのような他の技術とこの実験的なレイアウトの組み合わせは、非常に可能であり、さらにinsiが得られるはず共同の感染症に関与するメカニズムにghts。また、ウイルスのサイクル（ウイルス融合、decapsidation、エントリの定量）の初期段階を評価するための特異的なアッセイは、さらにウイルス複製に及ぼす影響を分析するためにこの基本的なプロトコルに適用することができます。トリチウム標識ヌクレオチドは、おそらくHIV-1 p24抗原のELISAを置き換えることができますを使用して実際にも、標準的なHIV-1逆転写定量アッセイ：これらの変更は、このプロトコルは、HIV-1定量と検出に関する方法を柔軟に表示されます。 MDMに加えて、我々のシステムがこのような単球や樹状細胞などのHIV-1マラリアの相互作用に関連する他の細胞型への適応になることを期待しています。 MDMは、接着細胞であるという事実は、任意のマクロファージを除去することなく、で撮影されていない、またはMDMとの接触にあることをIRBCの外に洗濯しやすいようにできるように、その操作を容易にします。このような利点は、それ自体を複雑に、懸濁液中で培養される樹状細胞や単球には適用されませんでしたそのような細胞とuRBCと自由IRBCのparation、我々は、現在この問題に取り組んでいる。私たちのシステムはまた、そのような共培養実験におけるCD4陽性T細胞のような他の免疫細胞におけるHIV-1ウイルスのサイクルでマラリアにさらされた単球由来細胞の効果など、より複雑な相互作用を研究するのに便利かもしれません。最後に、我々のプロトコルは、Pの影響を見て実験に適している可能性がHIV-1感染者のためのPBMCにおけるHIV-1再活性化で熱帯熱マラリア原虫の iRBCs。

倫理文

ヒトPBMCは、センターHospitalierエトワールラヴァル大学研究センターの倫理委員会のガイドラインに従って、健康なドナーの血液から得られた。書面による同意は、すべての血液ドナーから得られた。

開示事項

利害の衝突が宣言されません。

謝辞

この作品は、CatalystのCo-感染症や合併症の助成を通じて、健康研究のカナダの協会によってサポートされていました。ヒト赤血球は、センターHospitalierエトワールラヴァル大学血液バンクから提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
RPMI 1640 マルチセル 350から000-CL
PBS-エンドトキシンフリーシグマ D8662
FBS Wisent 080から150 30分間56℃での熱不活化
Accutase eBiosciences 00-4555-56
Albumax II ギブコ 11021-037 RPMI 1640に溶解し、フィルター滅菌
リンパ球分離媒体マルチセル 305から010-CL
白色ルミノメータープレートプロメガ Z3291
CSのMac分離columms ミルテニーバイオテク 130-041-305
VarioMacsセパレータミルテニーバイオテク 130-090-282
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 Wisent 450から201-EL
D-ソルビトール Sigma-Aldrich社 S1876
セルスクレーパー（25センチ） ザルスタット 83.1830
24ウェル細胞培養プレート BDファルコン 353047
150×20 mmの培養皿ザルスタット 83.1803.003
M-CSF Genscript Z02001
HEPES Sigma-Aldrich社 H4034
ヒト血清AB + バレーメディカル HP1022
HBSS Wisent 311から505-CL
ゲンタマイシン Sigma-Aldrich社 G1397
ヒポキサン​​チン Sigma-Aldrich社 H9636
NaHCO 3を Sigma-Aldrich社 S5761
ルシフェラーゼアッセイシステムプロメガ E1500
ヒト赤血球得は、哲血液バンクから精製された。

参考文献

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