外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

サマリー

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。

要約

哺乳類成体脳における神経幹細胞および前駆細胞の発見（以下総称して呼ばれる神経前駆細胞）（NPCは）神経再生戦略の開発のため、これらの細胞の多能性や増殖特性を利用することを目的とした研究の本体につながっている。そのような戦略の成功のための重要なステップは、外因性の移植後の病変部位に向かってNPCの動員であるかCNSの脳室周囲白質領域で発見された内因性の前駆体の応答を増強する。したがって、それは、推進導き、NPCの移行を強化するメカニズムを理解することが不可欠です。走電性として知られている現象 - 私たちの仕事は、NPCの移行を促進し、指示するために直流電界の利用（dcEFs）に焦点を当てています。内因性の生理的な電界が正常な発達と創傷修復中に細胞遊走のための重要な手がかりとして機能する。の薬理学的混乱アホロートル胚におけるトランス神経管電位は重度の発達奇形^1を引き起こします。このDCEF ^2-3の薬理強化や中断によって示されるように、創傷治癒のコンテキストでは、傷ついた角膜の修復速度が直接、損傷後生じる上皮創傷電位の大きさと相関している。我々は、外部から印加されたDCEFにさらされたときに成人上衣下NPCが試験管内で迅速かつ監督陰極移行を受けることを明らかにした。このプロトコルでは、高分解能、単一細胞レベルでディレク細胞体転座（マイグレーション）の長期観測のためのシンプルで効果的な走電性アッセイを作成するために私たちの研究室の手法について説明します。このアッセイは、トランスジェニックやノックアウトマウスでは、短鎖干渉RNA、または特定の受容体アゴニスト/アンタゴニストの使用を介して細胞の運動性にdCEFの伝達を制御するメカニズムを調査に適しているであろう。

プロトコル

動物の取り扱いに関係するすべての手順は、制度ガイドライン（プロトコルはありません。20009387）に従い、トロント動物ケア委員会の大学によって承認された。次のメソッドは、該当する場合、層流フードで、無菌のツールやテクニックを使用して実行されるべきである。

以下のプロトコルのテキストでは、フレーズ "EFH-SFMは"上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子とヘパリンを補充無血清培地を指します。これらのマイトジェンは、未分化状態の⁴のNPCを維持するため、未分化NPCの走電性を調査するときEFH-SFMは使用されています。成熟細胞型に分化するように誘導NPCの走電性を調べるときは、 "FBS-SFMは、" 1％ウシ胎児血清を添加した無血清培地を指します。 FBSは、成熟した神経表現型⁵にNPCの分化を促進する。

1。神経前駆細胞の単離および培養（ない）映像に示すように

1. 頸椎脱臼経由イソフルランと犠牲とCD1マウス（6-8週齢）Anaesthetize。
2. 70％エタノールでヘッドを消すと鋭い解剖ハサミで動物を斬る。
3. 外科手術用鉗子で頭を押さえながら、頭蓋骨を露出するために背側表面に皮膚を削除します。
4. メスとNOを使用。 11ブレードは、中外軸に沿って、またrostrocaudal方向に矢状縫合に沿って前頭洞で頭蓋骨を獲得。
5. 離れていないと頭から頭頂骨をはがします。 7曲がった鉗子ではなく、ピアス脳組織に世話をして。
6. 小脳の下から開始し、嗅球に向かって進ん脳の下の薄いへらを挿入します。鉗子で適所に頭蓋骨を押さえながら、そっと頭蓋骨から脳を引くとすぐに氷のように冷たい人工脳脊髄液（以下のレシピを参照してください）​​に入れてください。
7. 解剖顕微鏡下では、無菌の使用解剖用はさみや鉗子は正中線に沿って半分に脳を切った。内側（カット）面が上方を向くようにそれぞれの半球を回転させます。
8. 半球を選択して、内側面を上に向けて、脳梁（脳梁の後部領域）の膨大部を見つけます。
9. 皮質の表面からの背腹軸に沿って脳梁膨大部への切り込みを入れる。
10. 側脳室の内側と外側の壁を露出させるために嗅球に向かって切開皮質ピール。
11. 背面が上方を向くように半球を回転させたり、切り取ってNPCが^6に存在する脳室周囲白質領域が含まれている露出した内側と外側の壁を収集するために湾曲したmicroscissorsを使用しています。
12. 他の半球の手順1.8から1.11までを繰り返します。
13. 15ccのチューブ内のトリプシン溶液（下記レシピを参照してください）​​の7ミリリットルに単離された組織をピペットで、37°C​​でロッカー上にチューブを配置25分間インキュベーター。
14. 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、上清を吸引し、（下のレシピを参照してください）​​トリプシンインヒビター溶液2mlに組織を再懸濁する。
15. ゆっくり気泡を避けるために慎重に小さなボーリング孔パスツールピペット30から50回で組織をひいて粉にする。
16. 、5分間1,500 rpmでチューブを遠心し上清を吸引し、ペレットを3-5回摩砕することにより、SFM中1-2ミリリットル（下のレシピを参照してください）​​に再懸濁します。
17. 3分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、SFMの1ミリリットル+ EFHで清と再懸濁を吸引除去する。
18. SFM + EFHでμlあたり10細胞の密度でT25培養フラスコ内の血球とプレート細胞と生細胞密度をカウントします。
19. 文化はNPCに成る自由浮動プライマリーニューロスフィアを得るのに邪魔されずに7日間成長することができます。

2。走電性商工会議所の準備

1. NO 3正方形のガラスを置きます。 1カバースリップ（22×22×0.17ミリメートル）は、i一晩の6N塩酸Naのボトル。
2. 翌日には、正方形の無からのガラスの6短冊（22×5×0.17ミリメートル）をカットするダイヤモンドチップガラスカッターを使用しています。 1カバースリップ。
3. 層流フード内に酸洗浄した正方形と長方形のスリップスリップを転送します。組織培養グレードの水でオートクレーブした後、70％エタノールを持つ最初の長方形と正方形のストリップを洗い、拭いてキムに乾燥することができます（追加された不妊のため、ガラスは空気乾燥させることができる）。
4. 正方形のガラススライドの一方の面の周囲に真空グリースを塗布し、60ミリメートルプラスチックペトリ皿の底にそれらを封印。
5. 長方形のガラス片の一方の面の長軸に沿って、真空グリースを塗布し、中央の谷を作成するために正方形のガラススライドの反対側のエッジ（彼らが互いに平行となるように）にそれらを封印。
6. 層流フード内に少なくとも15分間のチャンバを紫外線殺菌。
7. ポリ-L-lysiの250から300μlのピペット2時間室温でインキュベート室及び中央トラフの上にね。
8. 潜伏期間の終了前の約15分間は、（下のレシピを参照してください）​​マトリゲル溶液を調製します。
9. ポリ-L-リジンを吸引除去し、オートクレーブ滅菌水1ml、中央谷の上にマトリゲル溶液をピペット250から300μlで中央の谷を洗います。
10. 1時間37℃でチャンバーをインキュベートする。
11. マトリゲルの液を除き、穏やかに、SFM中1-2 mlの中央谷を洗う。
12. 中央の谷へEFH-SFMまたはFBS-SFMの各々100μL添加し、カウントを顕微鏡のステージ上に走電性チャンバーを転送します。
13. ピペット3月4日60ミリメートルペトリ皿に神経球含有培養mlのはカウント顕微鏡のステージにシャーレを転送します。
14. 5倍の視聴目的で、それぞれの走電性の中心トラフに5月8日全神経球（最大4時）に転送するためにP10のピペットを使用それらを解離させずにチャンバー、慎重マトリゲル基板を中断せずに、中央の谷の周りの神経球を広げた。
15. 中央の谷にEFH-SFMまたはFBS-SFMの追加の150から200μlを添加する。
16. 37℃、5％CO _2、17から20時間後には100％の加湿インキュベーターに走電性チャンバを転送（もし未分化のNPCを分析）を図1に示すように、ニューロスフィアは、マトリゲル基板に付着し、単一細胞に解離できるようにする。差別化されたNPCを分析する場合、潜伏期間は、細胞の分化を可能にするために69から72時間に延長すべきである。

3。細胞タイムラプスイメージングを生きる

1. ライブセルイメージングシステムは、37℃で平衡化させ℃、5％前タイムラプス撮影開始までの30分の最小のCO _2。
2. 一方の端部から直径1mmのシルバーワイヤー、コイルふたり12cmの部分をカットし、クロロックスbにそれらを配置する銀/塩化銀電極を形成するために、20分間浸出する。
3. 計数顕微鏡のステージ上に走電性室を移し、次の基準に基づいてライブセルイメージングの移行解析のために使用される室を選択します：i）ニューロスフィアは、単一細胞にほぼ完全に解離しなければならないと、ii）細胞が持っている必要があり少しツーないプロセスと丸い形態は、細胞体から伸びる。
4. 別の方形な​​いとともに、層流フードに選択された走電性チャンバーを転送します。 1ガラスカバースリップと真空グリース。
5. オートクレーブした水で、次に70％エタノールを用いて第一滑り、カバースリップの2つの平行な辺に真空グリースのストリップを適用するカバーを洗う。
6. 、室の中央トラフから培地を吸引除去した後すぐに2つの平行な矩形状のガラス片にグリスストリップの残りの部分は、効果的に屋根を作成するようなチャンバー上にカバースリップ（グリース側を下に向け）を配置室へ。
7. 毛細管現象を介して中央の谷に新鮮EFH-SFMまたはFBS-SFMの各々100μL添加します。
8. 図2に示すように、中央の溝の両端に培地のプールの境界線を作成するために真空グリースを使用しています。
9. PVCチューブの2 15cmの部分をカットし、丁寧に泡がチューブ内に形成されないの確保、チューブにアガロース溶液を注入する18ゲージの針で10ccのシリンジを使用し、ゲルを5分間凝固させる。
10. アガロースゲルチューブ、銀/塩化銀電極、および培養培地リザーバーとして使用される空の60ミリメートルペトリ皿のペアと一緒に、ライブセルイメージングシステムへの走電性チャンバーを転送したAg / AgCl電極を含んでいます。走電性チャンバーは37内に物を置か℃、20〜30分間、5％CO ₂環境。
11. この時間の間に、ドリルで穴を開けることによって2つの空のペトリ皿のふたと走電性室のペトリ皿の蓋を準備それらの中に、図3に示すように、ドレメルまたは同様のツールを持つ。
12. ピペット中央谷の両側の上EFH-SFMまたはFBS-SFMは1〜1.5 mlを加え、それぞれの空のシャーレにSFM 7-8 mlであった。各皿に走電性チャンバーの中央トラフと場所1 Ag / AgCl電極の両側に1つ配置シャーレ。 図4に示すように、アガロースゲルブリッジとの電気的導通を確立するために、走電性チャンバー、ペトリ皿とのギャップを埋める。
13. 電流を測定するために直列に電流計で、外部電源に銀/塩化銀電極を接続し、電源をオンにします。所望の電界強度が達成されるまで、直接中央谷を横切って電界強度を測定し、電源の出力を調整するために電圧計を使用します（このラボで行わアッセイはで250 mVの/ mmのdCEFの強みを活かし1と1.5ミリアンペア）の間に電流。
14. イニシアTEは、タイムラプスライブセルイメージングシステム上のモジュール、および実験は、目的の時間のために実行することができます。検定終了後、標準の免疫染色解析のため、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。

結果

キネマティック解析は、250 mVの/ミリメートルDCEFの存在下で、未分化なNPCが陰極に向かって非常に導かれ、急速な走電性（ 図5A、映画1）を示すことが明らかになった。 DCEFの非存在下では、細胞のランダムな動きが（ 図5B、ムービー2）が観察された。この電界強度では、未分化のNPCの> 98％が撮像されているために全体の6〜8時間のために移行し、死細胞は移行されませんので、これは彼らがdCEFの非存在下または存在下で、この期間中に生き続けることを示唆している。

差別化された表現型は、両方の存在およびdCEFの不在（ 作品3、4）は無視できるマイグレーションを受ける。分化した細胞のサブセットは、dCEFの方向に対して垂直に整列する傾向があるプロセスを拡張しますが、目立った細胞体の転座は観察されない。

免疫染色では、NPCが正expressioを維持していることを検証N DCEF露光（ 図6A）

ディスカッション

このプロトコルは、先行研究^7-9のよく確立された方法の中から適応されています。 Galvanotactic室は、細胞播種の閉じ込めのためのよく独立したガラス張りの建設を含むさまざまなテクニック、のさまざまな方法を使って、または中央トラフ^10,11の微細加工にCO ₂レーザーアブレーション法を用いて構築することができる。いくつかのテクニックは他よりも面倒でコストのかかるかもしれません。我々は一般的にほとんどの細胞生物学研究室で見つかった材料を使用してNPCの走電性チャンバーを構築するための簡単​​かつ費用対効果の高いアッセイを記載している。我々のプロトコルは、継続的な長期的イメージングのために最適な条件で細胞を維持するために、ライブセルイメージングシステムを囲む、加湿、加熱されたCO ₂インキュベーターレギュが含まれています。このような装置の欠如は、いくつかの以前に発行された技術は^9,12の制限です。

別のグループによる最近の研究では同様のガルバを実証異なるプロトコルや、その...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アイテムの名前	会社	カタログ番号	注釈
			神経前駆細胞の単離
2MのNaCl	シグマ	S5886	100ミリリットルのdH 2 Oに溶解11.688グラム
1MのKCl	シグマ	P5405	100ミリリットルのdH 2 Oに溶解した7.456グラム
1M MgCl 2を	シグマ	M2393	100ミリリットルのdH 2 Oに溶解20.33グラム
155 MMのNaHCO 3	シグマ	S5761	100ミリリットルのdH 2 Oに溶解した1.302グラム
0.5Mグル​​コース	シグマ	G6152	100に溶解し9.01グラムミリリットルのdH 2 O
108 mMのCaCl 2	シグマ	C7902	100ミリリットルのdH 2 Oに溶解した1.59グラム
ペニシリン - ストレプトマイシン	ギブコ	15070
ウシ膵臓トリプシン	シグマ	T1005
羊は精巣ヒアルロニダーゼ	シグマ	H6254
キヌレン酸	シグマ	K3375
オボムコイドトリプシンインヒビター	ワージントン	LS003086
DMEM	インビトロジェン	12100046
[F12]	インビトロジェン	21700075
30％のグルコース	シグマ	G6152
7.5パーセントのNaHCO 3	シグマ	S5761
1M HEPES	シグマ	H3375	100ミリリットルのdH 2 Oに溶解23.83グラム
L-グルタミン酸	ギブコ	25030
EGF	インビトロジェン	PMG8041	20μlの単位にホルモンミックスとアリコート1mlの溶解。
FGF	インビトロジェン	PHG0226	20μlの単位にホルモンミックスとアリコートを0.5mlで再構成する。
ヘパリン	シグマ	H3149
アポトランスフェリン	R＆Dシステムズ	3188-AT	0.1gを4ミリリットルのdH 2 0に溶解
プトレッシン	シグマ	P7505	そうアポトランスフェリンに9.61 mgを溶解分離能
インスリン	シグマ	I5500	0.1NのHClを0.5mlに25mgを溶解するとdH 2 0の3.5ミリリットルに追加
セレン	シグマ	S9133
プロゲステロン	シグマ	P6149
標準解剖ツール	ファイン科学ツール
解剖顕微鏡	ツァイス	STEMI 2000
			走電性商工会議所の準備
正方形のガラスカバースライド	VWR	16004
6N塩酸	VWR	BDH3204-1
高真空用グリース	ダウコーニング
60ミリメートルペトリ皿	フィッシャー·サイエンティフィック	0875713A
ポリエルリジン	シグマ	P4707
マトリゲル	BD Biosciences社	354234	150μlの単位に解凍し、アリコート
FBS	インビトロジェン	10082139	上記で示したように、NPCの分化を誘導する場合にのみ使用し、それ以外の場合は、SFM + EFH培養培地を使用
計数顕微鏡	オリンポス	CKX41
			細胞タイムラプスイメージングを生きる
銀線	Alfa Aesar社	11434
超高純度アガロース	インビトロジェン	15510-027
熱Inactivated FBS	シグマ	16140071
PVCチューブ	フィッシャー·サイエンティフィック	80000006	3/32 "内径x 5/32" OD
漂白剤	クロロックス
10ccの注射器	BD	309604
18ゲージの針	BD	305195
ドレメルドリル	ドレメル	モデル750
加湿、インキュベート室を備えた倒立顕微鏡	ツァイス	AXIOVERT-200M
			レシピ アイテム ボリューム 2MのNaCl 6.2ミリリットル 1MのKCl 0.5ミリリットル 1M MgCl 2を 0.32ミリリットル 155MMのNaHCO 3 16.9ミリリットル 1Mグルコース 1ミリリットル 108 mMのCaCl 2 0.09256ミリリットル ペニシリン - ストレプトマイシン 1ミリリットル オートクレーブ処理水 74ミリリットル 人工脳脊髄液 アイテム 体積または質量 人工脳脊髄液 30ミリリットル ウシ膵臓トリプシン 40 mgの 羊は精巣ヒアルロニダーゼ 22.8ミリグラム キヌレン酸 5mgを のトリプシン溶液 アイテム 体積または質量 SFM 15ミリリットル オボムコイドトリプシンインヒビター 10mgを トリプシン阻害剤溶液 アイテム ボリューム オートクレーブ処理水 37ミリリットル 10X DMEM/F12 10ミリリットル 30％のグルコース 2ミリリットル 7.5パーセントのNaHCO 3 1.5ミリリットル 1M HEPES 0.5ミリリットル トランスフェリン、プトレシンソリューション 4ミリリットル 25mgのインスリン溶液 4ミリリットル セレン 100＆ムー;リットル プロゲステロン 100μlの ホルモンミックス （-20℃で100mlの合計、店舗） アイテム ボリューム オートクレーブ処理水 37.5ミリリットル 10X DMEM/F12（3:1） 5ミリリットル 30％のグルコース 1ミリリットル 7.5パーセントのNaHCO 3 0.75ミリリットル 1M HEPES 0.25ミリリットル ホルモンミックス 5ミリリットル L-グルタミン酸 0.5ミリリットル ペニシリン - ストレプトマイシン 0.5ミリリットル 無血清培地EFH-SFM：0.5ミリリットルのFBSを追加したEGFの10μlに、FGFの10μl、およびヘパリンFBS-SFMの3.66μlを加える
アイテム	ボリューム
マトリゲル	150μlの
SFM	3.6ミリリットル

アイテム	体積または質量
超高純度アガロース	10ミリリットルのddH 2 0で300mgの
SFM 熱不活性化FBS	8ミリリットル 2ミリリットル