患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

サマリー

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。

要約

循環腫瘍細胞（CTC）、循環器系全体に原発腫瘍から普及し、最終的に遠隔サイトでの二次腫瘍を形成することができる細胞である。 CTC数が血液や疾患の重症度¹のCTC濃度との相関関係に基づいて疾患の進行を追跡するために使うことができます。治療ツールとして、CTCは、パーソナライズされた治療法を開発するために実験室で研究することができます。この目的のために、CTCの分離がなく細胞の損傷、特に他の細胞型、白血球による汚染を引き起こしてはならない、できるだけ²として避けなければならない。 CTCの列挙のための唯一のFDA承認されたデバイスを含めて、現在の技術の多くは、（詳細については、文献[2]を参照してください）​​分離プロセスの一環としてCTCを破壊する。実行可能なCTCをキャプチャするためのマイクロ流体デバイスは、上皮マーカ³に対する抗体に加えて、E-セレクチン糖タンパク質で官能面で構成され、説明されています。デバイスの性能を向上させるマンスナノ粒子コーティングは、ハロイサイトナノチューブから成る粘土⁴から収穫アルミノケイ酸塩ナノ粒子を適用した。 E-セレクチン分子は、別のマイクロ流体デバイス上の利点は、より長い処理時間は、表面と相互作用するのに十分な時間と標的細胞を提供するために必要である請求貸す、デバイスを介してポンピングされる動きの速いCTCをキャプチャするための手段を提供します。上皮のターゲットに対する抗体は、デバイスにCTC特異性を提供するとともに、分離を調整するために容易に調整可能なパラメータを提供しています。最後に、ハロイサイトナノチューブのコーティングはタンパク質吸着のために表面積の増加を提供し、大幅に強化されたアイソレーションは動きの速い細胞をキャプチャするために支援することで、他の技術に比べて可能にし、混入白血球の^3,4を撃退。このデバイスは、既製の材料を使って簡単な手法によって生成され、正常に転移の血液からがん細胞を捕捉するために使用されていますがんの患者さん。キャプチャされた細胞は、分離後に文化の中で、最大15日間維持し、これらのサンプルは、通常、各患者からの> 50％可能な主要な癌細胞で構成されています。さこのデバイスは、希薄化後の全血およびバフィーコートサンプルの両方から可能なCTCをキャプチャするために使用されています。最終的に、私たちはパーソナライズされた癌治療を開発するために臨床の現場で機能を持つ手法を提示します。

プロトコル

次のプロトコルは、単一のマイクロデバイスの製造のためのものです。

1。ハロイサイトナノチューブ溶液の調製

1. 超音波処理（10〜13 W（RMS））250μLハロイサイトナノチューブの溶液（水で6.6重量％）30秒。一度冷たい水と繰り返し超音波のクールなソリューションを提供します。再び冷却する。
2. シリンジに超音波処理したソリューションを引く、きれいな微量遠心チューブに0.45μmのシリンジフィルター、およびフィルタソリューションを添付してください。均質性を維持するために、時折渦ソリューションを提供します。

2。ハロイサイトナノチューブとマイクロチューブ内表面のコーティング

1. 50センチメートルマイクロRenathane microtubingの長いセクション（300μmの内径、35.3μLの内部ボリューム）を取得します。対角でチューブの一方の端を切り取り、小さなIDEXアダプタ部分に挿入します。チューブのもう一方の端に3月10日CC 29G注射器の針を挿入します。
2. マイクロチューブをきれいにするには、チューブの開放端（エンド配置アダプタ付き）70％エタノールにしてチューブを埋めるために注射器に約50μLのエタノールを描画します。
3. 注射器に蒸留水の寛大なボリュームを描画することにより、マイクロチューブのエタノールをすすぐ。
4. マイクロチューブからシリンジを外します、注射器を空にし、マイクロチューブに再接続します。
5. 水の中のリジン0.02パーセントw / vのポリ-Lの溶液を調製します。マイクロチューブに50μLを描画し、室温（RT）で5分間座ってすることができます。
6. マイクロチューブに100μLのろ過ナノチューブ溶液を描画し、室温で3分間インキュベートすることができます。
7. ナノチューブ溶液をリンスするためにチューブを介して100μLの水を描画します。 RTで一晩、水で満たされた、座って被覆したマイクロチューブを許可します。

3。細胞分離用マイクロチューブの調製

1. 1Xダルベッコのリン酸塩の10μg/ mLのタンパク質Gの溶液を調製します（ - 7.2 PBS、pH7.0）で緩衝生理食塩水。マイクロチューブを介して50μLのPBSを描画してからの50μLを描くプロテイン-G溶液と室温で1.5時間インキュベートすることができます。
2. 5μg/ mLのE-セレクチン-IgGとPBSで50μg/ mLの抗体（ほとんどの癌サンプル、抗PSMA前立腺癌サンプルの抗-EpcAM）を含む溶液を調製します。マイクロチューブにE-セレクチンと抗体溶液50μLを描き、室温で2時間インキュベートすることができます。
3. 非特異的な細胞接着は、5％乳タンパク質でブロックされています。 5％（w / v）を、PBS中の乳蛋白質の溶液を調製します。マイクロチューブに50μLの乳蛋白質溶液を描画し、室温で1時間インキュベートすることができます。
4. チューブに50μLのPBSを描画し、血液やバフィコートサンプルを処理するための準備が整うまで室温で残す。
5. 前の絶縁のためのマイクロチューブを使用して、〜10分、セレクチン分子をアクティブにするのCa ^{2 +（} "PBS +"）で飽和された50μLのPBSを描画します。

4。細胞分離用サンプルの調製

1. 患者からヘパリンに10 mLの血液を描画または取得チューブ。
2. 50 mLの遠心チューブに10 mLの場所をFicoll-Paqueリンパ球分離液。フィコールの上にそっと層10 mlの全血がように血とフィコールを混在させないように。
3. °C最小限の減速で4℃15分間2000X gで遠心分離します。
4. 新しいチューブにバフィーコート層と場所を削除します。
5. PBSで洗浄バフィーコート（10分間230x gで遠心し、上清を捨てる）。
6. 静かに1 mLの赤血球溶解バッファーで細胞を再懸濁し、赤血球を溶解する室温で10分間インキュベートする。
7. 10 mLのPBS、穏やかに混合し、10分間230x gで遠心分離を追加します。上清を捨て、ゆっくりと3から4 mLのPBS +でペレットを再懸濁します。

5。細胞単離

1. IDEXのアダプタを使用して5 mLシリンジに官能チューブの一方の端を取り付けます。
2. シリンジポンプにシリンジを挿入します。
3. 水没セルサスペンシオに、官能チューブの開放端N。
4. 1から4 ml /時間でチューブを介して細胞懸濁液を処理します。
5. PBSを含むチューブにチューブの開放端を転送+とチューブから非結合と疎結合した細胞を除去するために0.016 mL / minでシリンジに300μLのPBS +を描画します。
6. きれいなチューブにチューブの開放端に配置します。マイクロチューブからシリンジを取り外し、Accutaseとプレフィルドシリンジを接続します。そっと埋めるためにマイクロチューブに十分なAccutase（〜50μL）を灌流し、10分間室温でインキュベートすることができます。
7. プレートよく扱わ組織培養に廃液収集し、マイクロチューブに増殖培地を1 mL（79％RPMI、20％FBS、1％ペニシリンストレプトマイシン）とプレフィルドシリンジと灌流を添付してください。
8. 37℃で培養細胞℃、加湿条件の下で5％CO _2。

6。代表的な結果

この手法の目的は、癌患者の血液から生存癌細胞を単離することである。デバイスの成功に必要な検証、いくつかの方法では、文化の中でがん細胞を識別するために存在しています。我々は、無傷の細胞核（図2および3）を識別するためにDAPIに加えて、そのようなEpCAM（上皮細胞接着分子）またはPSMA（前立腺特異的膜抗原）などの上皮部分に対する抗体で培養中の細胞を染色することを選択しました。癌細胞の数は、このテクニックを使用してキャプチャ必ずしも出発試料にCTCの数の関数であり、患者のばらつきが高くなることがあります。 IV期のがんと診断された患者から採取したサンプルを処理する際に、我々は日常的に純度の血液のチューブあたり100〜500癌細胞、> 50％をキャプチャします。直ちに分離後に、汚染白血球の大きい番号が存在する可能性があります。しかし、これらの番号は、最大5日間の培養培地中でのインキュベーション後に枯渇されます。

図1。抗体媒介静的接着に続いセレクチンを介した転がりを示すCTCの分離のための官能チューブの模式図。

図2乳癌患者および肺癌患者から採取した血液サンプルからのCTCの分離の代表的なデータです。 EpCAM染色に基づいて積極的にCTCとして識別され、生存細胞の数は、固体のバーや左側の縦軸と捕捉された細胞の総数と比較して、CTCとして同定された細胞の割合に関係で表されているオープンのバーで表され、右側の縦軸上で測定。結果は、文化の中で五日後にされています。

isolati〜5日以降の文化の中で、CTCの独立したドナー（AとB）から図3代表的な顕微鏡写真癌患者の血液サンプルから上に。細胞は、蛍光核（青）を可視化するためにAlexaFluor 488 EpCAM（緑）と4 ',6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）で染色した。

ディスカッション

それはしばしば、新しいがん治療薬の発見の初期段階は、原発性癌細胞への不審な似ても似つかない癌細胞株は、まだ実験室での使用の容易さのために使用のままに利用する場合があります。主要なヒト癌細胞が早期に小説の研究で利用された場合は、新しいがん治療法の開発への研究が促進されるでしょう。 CTCは、癌細胞、血液中の彼らの存在のために、標準的な採血のしやすさの中で最も簡単にアクセスできるタイプです。さらに、循環腫瘍細胞が転移^5,6の過程で必要なステップを表すので、新しい薬を標的とする疾患やユーティリティとの関連性は明らかである。 in vitroでの血液からCTCの分離は、その低濃度によって複雑にされています。百万ごとに白血球や赤血球億⁷あたり1つのオーダーで。唯一のFDA承認されたテクニックセルを含む、血液中のCTCを検出するための現在の方法の大部分は検索（Veridex）、損傷または列挙を超えての使用を排除し、検出プロセスで細胞を破壊する。上記の方法は、細胞の生存を危うくするので、がんについての将来の臨床研究のためにドアを開きません。無傷の細胞の回復がこの技術の目標であるとして、それは細胞が特に血液分離のステップの間に、注意して扱われることが不可欠です。

そのような癌の種類などの重要な特性に応じて改善された収率を達成するために変更することができ、このシステムの調整可能なパラメータの数があります。上記の手順では、我々は前立腺癌のサンプルを処理する場合を除き、すべてのがんのタイプのCTC固有の抗体としてEpCAMを使用するように選ばれた、前記抗PSMAが使用されています。癌特異的抗体の更なる置換は確かに個々の患者のためにパフォーマンスを向上させるために使用することができます。また、セレクチンおよび抗体の濃度は、キャプチャ^8を高めるために変更することができます。

">デバイスの本質的な特徴は、表面にE-セレクチン分子の取り込みです。E-セレクチンは、通常、内皮細胞、炎症部位への高速移動白血球を募集するための関数の管腔表面に発現しています。流れる白血球を一時的にバインドするセレクチン分子、インテグリンによる内皮細胞への細胞のいずれか遅い方と強い結合を容易にし、低速回転動作が生じる。説得力のある実験的証拠は、CTCが同様のメカニズム^9,10によって浸出することができた場合になりますが存在します。セレクチンを含めることもデバイスが大きい流量で運転することができ、それ以外の抗体¹¹に結合することから細胞を妨げる率は。従って、私たちのデバイスは、生理的にbiomimetically細胞傷害を負わせずにCTCを流れるキャプチャするために静脈を模倣しています。

エンハンスド·デバイスのパフォーマンスは、管腔表面にハロイサイトナノチューブコーティングの添加に起因することができますデバイスの。以前の研究では改良された機能を可能にするナノチューブコーティングの3つの主要コンポーネントがあることが示されている。最初に、ナノチューブのコーティングは、表面^4の上に大きなタンパク質の沈着を考慮して、増加した表面積を提供します。第二に、ナノチューブのコーティングに原子間力顕微鏡を実行する際に我々は個々のナノチューブは、フローに表面から突出していることが決定した。これは、細胞が管⁴を介してキャプチャされ、以前の彼らの軌跡の表面に補充できるように、セレクチン分子が表面に上記のように多くの一つとして、ミクロンを提示することができます。最後に、ハロイサイトナノチューブのコーティングは、白血球の接着とCTC、したがってより大きな後続CTC純度³と共にキャプチャされた白血球の数を減らすことを可能にし、表面上の拡散を防止することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
300 UM IDチューブ	トリーサイエンティフィック	MRE025
シリンジに接続するための大きなチューブ	IDEXヘルス＆サイエンス	1507L
ポンプの5mLのシリンジ	BD	309603
大型チューブに小さなコネクタ	IDEXヘルス＆サイエンス	P-770
注射器のコネクタ大型チューブ	IDEXヘルス＆サイエンス	F-120とP-659
マイクロシリンジ（3/10ccインスリン注射器U-100 29G 1/2 "）	BD	309301
Accutase	MPバイオメディカルLLC	1000449
Ficol X線不透過性のプラス	GEヒールthcareバイオサイエンスAB	17-1440-03
RBC溶解バッファ（buffer EL、1000mlに）	キアゲン	1014614
プロテインG、5 mgの	カルビオケム（calbiochem.com）	539303
人間EpCAM/TROP-1抗体	R＆Dシステムズ	MAB960
PSMA抗体（GCP-04）	アブカム	ab66911
96ウェルプレート（マイクロテスト96）	BDファルコン	35から3072
ブロッティンググレードブロ​​ッカー脱脂粉乳、300グラム	バイオ·ラッドラボラトリーズ	216005508
ハロイサイトナノチューブ	NaturalNanoの	NN-HNT200
炭酸カルシウム、5グラム	アルドリッチ化学	481807
rhE-Selectin/Fcキメラ、100μgの	R＆Dシステムズ	724-ES
RPMI培地1640	ギブコ	22400-089
DPBS	ギブコ	14190-095
水のポリ-Lリジン0.1％w / vの	Sigma-Aldrich社	P8920-100ML
ソニックDismembrator	フィッシャー·サイエンティフィック	モデル100
ウシ胎児血清	アトランタの生化学	S11056H
ペニシリンストレプトマイシン	シグマライフSiiences	P0781