サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。
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この記事について
サマリー
要約
生物物理学的特性および単一ニューロンの機能的な組織を理解し、それらがどのように情報を処理する脳がどのように機能するかを理解するための基本です。任意の神経細胞の主な機能は、通常、複数の情報源から、電気信号を処理することです。神経突起の電気的特性は、詳細な測定の不存在下で予測することは非常に、複雑でダイナミック、そして、一般的な場合では、不可能である。彼らは活動電位の開始に影響を与えるために特定の場所で神経プロセスと合計する上の原点のサイトから移動する際に、複数のサイトで、サブスレッショルドイベントを一つは、理想的には、監視できるようにしたいと思い、このような測定を得るために。この目標は、電極を用いる測定の技術的制限により、任意のニューロンで達成されていません。この欠点を克服するために、それは大規模な並列recordinを許可するイメージング技術でパッチ電極のアプローチを補完することが非常に望ましいニューロンのすべての部分からのGS。サブミリセカンド、サブマイクロメートルの分解能によって特徴付け-有機電位感受性色素（V メートルイメージング）と膜電位の過渡光記録-ここでは、このような手法を説明します。我々の方法は、電位感受性分子プローブ2の先駆的な研究に基づいています。初期の技術の多くの側面を連続数十3、5、11より改善されてきた。また、前作はV メートルイメージングの二つの本質的な特性を文書化した。まず、蛍光シグナルは、全体の生理的な範囲で膜電位（、10、14、16、100 mVから-100 MV）に直線的に比例します。第二に、ここで使用される電圧感受性色素（JPW 3028）と、ロード·ニューロンは、検出可能な薬理作用を持っていません。色素ローディング中にスパイクの広がり記録、7 4完全に可逆的である。さらに、実験的証拠は、それが得ることが可能であることを示しています前の任意の検出可能な光毒性効果4、6、12、13への録音のかなりの数（最大数百人まで）。現在のところ、我々は、V メートルイメージング技術の感度を最大にするために、最適に近い波長でのレーザ光 源の明るさと優れた安定性を活用しています。現在の感度は軸索と軸索側枝は、端末樹の枝、及び個々の樹状突起棘含むニューロンのすべての部分からV メートル過渡の複数のサイト光学録音を可能にする。信号の相互作用に関する情報が取得された定量的な解析だけでなく、ムービーの形で直接可視化することができます。
プロトコル
1。機器セットアップ
ステップ1.1。イメージングセットアップ
膜電位感受性色素信号を記録するための鍵は、適切なセットアップデザインです。我々は、3つのカメラを搭載した正立顕微鏡（オリンパスBX51WIまたはツァイスAxioExaminer）を使用します。セットアップはニコン60X/1.0 NAまたはツァイス63X/1.0 NAの水浸漬目標のいずれかを使用して、落射蛍光、広い視野顕微鏡モードでの励起光によって脳スライスにおける照明個々のニューロンのために設計されています。当社の顕微鏡は防振台にボルトで固定し、電動可動ステージを完備しています。各顕微鏡は、3つのカメラポートが装備されています。一台のカメラポートがビデオ顕微鏡（IR-1000、DAGE MTI、米国）赤外線DICのための標準的な高空間分解能のCCDカメラを持っています。第2のカメラポートは、比較的低い空間分解能（80×80ピクセル）が、優れたダイナミックレンジ（14ビット）と読み、非常に低いと、高速データ·アクイジション·カメラ（最大20 kHzのフレームレート）を有しているノイズ（NeuroCCD-SM RedShirtImaging LLCは、ディケーター、ジョージア州）。用共焦点画像のzスタックを収集するために使用スピニングディスク共焦点スキャナ（CSU-10、横河電機、日本）に搭載され、第3のカメラポートは、高空間分解能を持つCCDカメラ（PCO AG、ドイツP....
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結果
成功した共焦点顕微鏡は、スライスの表面に近いとフォーカスの一方の面に配置されている無傷の神経プロセスの明確な識別を可能にするべきである。前電位感受性色素負荷への電圧イメージングに適した神経細胞の選択は非常に重要です。皮質スライス（Crymトランスジェニックマウス系統）にEGFPを発現L5錐体細胞の共焦点画像の例を図2に示します。個々のニューロンの軸索は、はっきりと見える。スライスの表面に近い焦点の一つの面で長い無傷の軸索（白矢印）をもつ細胞を選択した。
図2：軸索からAP信号のV メートルイメージングのためのL5の皮質ニューロンの選択。同じスライス領域の低い（左）および高い（右）拡大画像;横河電機を使用して488 nmの励起ディスクスキャナをスピニング。
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ディスカッション
この記事では、サブミクロンおよびサブミリ時空間分解能で個々の神経細胞の電気的活動を監視するための電位感受性色素記録方法を説明します。最適に近い波長のレーザー励起が（信号の大きさに関して）従来のアプローチ以上〜50倍記録の感度を向上させました。感度電流は樹状突起、軸索、軸索側枝と軸索末端だけでなく、個々の樹状突起棘を含む個々のニューロンのすべての部分からの電気信号を、監視できます。現在の感度で、膜電位の過渡の録音は最大20 kHzまでのフレームレートで行うことができる。ささやかな信号平均（4月25日の試験では）容易に2から5倍の信号対ノイズ比として表さ録音の感度を向上させることができます。電圧イメージングの主な制限は、絶対電圧スケール上の複数の場所からの光信号の簡単なキャリブレーションの欠如である。いくつかの準備中sは、これはすべての場所での既知の振幅を有する膜電位信号を見つけることによって解決することができます。 6軸索で、いくつかの完全に興奮樹状突起のAP信号は、優れた校正標準を提供します。
この方法論の適用における重要なステップは次のとおりです。
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開示事項
デヤンZecevic彼はLLCをRedShirtImagingの共同経営者。、電位感受性色素記録に使用される高速、低ノイズCCDカメラに特化した会社であることを宣言します。他のすべての著者らは金銭的な利益または現在の研究に関連した潜在的な利益相反が報告されていない。
謝辞
私たちは親切に染料を提供するためレスリー·M.·レーブにだけでなく、この技術の初期開発に参加した私たちの共同研究者クヌートHolthoff、アーサーKonnerthとマルコCanepariに感謝しています。 NSFの助成金、IOS-0817969、NIHの助成NS068407とM136043で、エール大学神経科学カヴリ研究所によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コンポーネントの名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| セットアップコンポーネント | |||
| 正立顕微鏡 | オリンパス株式会社 | BX51WI | 3つのカメラのポートを持つ |
| 電動可動ステージ | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| オリンパスBX51用落射蛍光コンデンサー | フォトニクスTILL | 0000-560-11659 | |
| 正立顕微鏡 | カールツァイス、LLC | AxioExaminer D1は | 3つのカメラのポートを持つ |
| 電動トッププレート | Scientificaリミテッド | MMBP | |
| ツァイスAxioExaminer用落射蛍光コンデンサー | フォトニクスTILL | ||
| データ·アクイジション·カメラ | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | 高速、低読み出しノイズ |
| IR-DIC用CCD | DAGE-MTI | IR-1000 | |
| スピニングディスク共焦点スキャナ | 横河電機 | CSU-10 | |
| 共焦点スキャナの高空間解像度CCD | PCO AG | PixelFly | 1392x1024ピクセル |
| DPSS CWレーザ（波長532nm） | CNIのオプトエレクトロニクス技術。株式会社 | MLL-III-532 400mWの | 励起光源 |
| マルチモードファイバランチャー | Siskiyou | SM-CFT | |
| ライトガイド | 写真TILLのNIC | 0000-515-11524 | |
| シャッター | ヴィンセント·アソシエイツ | LS6 | |
| 防振台 | マイナスKテクノロジー | MK26 | |
| 特定の試薬 | |||
| ジ-2 - ANEPEQ（JPW 1114） | ライフテクノロジーズ | D-6923 | 電位感受性色素 |
| Crym-EGFPマウスライン | GENSAT（MMRRC） | ストックTG（Crym-EGFP）GF82Gsat/Mmcd | まばらにレイヤ5皮質ニューロンにEGFPを発現する |
参考文献
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1
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再版と許可
