Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

サマリー

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。

要約

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）からニューロンを生成するための既存のプロトコルはしばしば彼らが前終末分化に神経前駆細胞の単離および拡張を伴う多段階の手続であるという点で、手間がかかります。これらの時間のかかるアプローチと比較して、我々は最近、3シグナル伝達経路、TGFβ/SMAD2、BMP/SMAD1、およびFGF / ERK、を合わせた抑制が機能して神経細胞への分化即時続いhPSCs、神経外胚葉からの迅速な誘導を促進することを見出した。ここでは、さらに、その再現性を向上させ、半ばスループットのアプリケーションと互換性を持たせるために、小説multititreプレートフォーマットに我々の手順を適応している。それが付着した条件下でのニューロンへの分化の一層の4日間続いフローティング球における外胚葉形成の4日後（胚様体）を含む。このプロトコルを用いて得られたほとんどの細胞は双極感覚ニューロンであるように見えます。また、手順は非常に効率的であり、特定の専門的なスキルを必要とせず、コスト効率の高い小分子との単純な化学的に定義されたメディアに基づいています。これらの特長により、プロシージャは、さらなる機能調査のための有用なプラットフォームとしてだけでなく、どのようなタイプの人間の感覚神経細胞や神経細胞を必要とする細胞ベースのスクリーニングアプローチのための役割を果たすことができる。

概要

胚由来のヒト胚性幹細胞（hESC）や人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むhPSCsは、それらがin vitroで^1-2の様々な細胞系統を生じさせることができる多能意味です。多数の分化した細胞の種類は、これらの細胞は、科学的研究と細胞ベースのスクリーニングのアプローチのための貴重なツールを紹介し、細胞ベースの治療のための約束を保持するという考えを支持し、現在までにヒトES細胞に由来している。

ヒトES細胞の神経細胞分化プロトコルは、彼らはしばしば神経前駆細胞の分離マニュアル、および利息^3-6の与えられたニューロンタイプへのその後の最終分化に続いて、第1誘導全体の神経運命に基づいているため、通常、複雑で時間のかかるものです。いくつかの点では、この複雑さは、このような最先端の指示分化プロトコルを段階的に早い人間開発、whicを模倣する傾向があることを考えれば驚くべき、不可避ではないhはそれ自体が非常に複雑である。その一方で、それは部分的にもはるかに完全に最適化されてからまだ分化プロトコルで、その結果、根本的な分子過程の理解の我々の欠如を反映しているかもしれない。

神経外胚葉への分化hPSCsの変換につきましては、ペラら BMP / SMAD1/5/8シグナル伝達の抑制はhESCの⁷の神経誘導を増強することを発見した。また、SMAD2 / 3シグナル伝達の不活性化は神経外胚葉の形成^8を促進することが示されている。したがって、これら2つの経路の不活性化が組み合わさhPSCs ^4,9のより効率的な神経誘導につながる傾向。さらに最近では、我々は第三シグナル伝達経路は、FGF / ERKは、ヒトES細胞における神経外胚葉コミットメントの最も早い段階の強力なリプレッサーとして機能することが示されている。逆に、これらのすべての3つの経路の同時抑圧はと神経外胚葉にhESCの近傍同種の変換につながるわずか4日^10インチ続いて、機能的な神経細胞への高い効率的な終末分化は8日以内に観察された。得られたニューロンは、部分的に¹⁰彼らの急速な導出を説明するかもしれない末梢神経系の感覚神経細胞である可能性が高かった。感覚ニューロンのメンテナンスの欠陥は、家族性自律神経失調症¹¹などの特定のヒトの疾患の原因を考えられている。ニューロンの特定のタイプを必要としない適用の目的のためだけでなく、さらなる機能解析のために、hiPSC技術¹²に基づいて、そのような疾患をモデル化するため、この分化の手順では、有用な基礎を提示することができる。

しかし、差別化戦略は、我々は当初のhESCコロニー¹⁰の塊から胚体の関与形成（EBS）を採用し、これはEBのサイズに関する異質性のかなり度をもたらし、また、いくつかのCEのニューロン形成効率を損なうように見えたLLライン。また、EBのサイズの異質性に起因して、体系的にニューロン形成中および後に追加の成長因子または小分子の効果をテストする能力がやや混乱しているように見えた。

また、他のコンテキスト¹³に示すように、本 ​​報告では、我々は非常にサイズ制御された方法でEBを生成するための培地スループット互換、強制集約ベースの技術に我々の前の手順を適応した。続いて、96ウェルプレートのV字型のウェル中に生成されたEBを懸濁液中の神経外胚葉の形成を開始するために、U字型、超低付着の96ウェルプレートに移した。 4日後、EBは、高効率と均一性で分化した神経細胞を生じさせるプレーティングすることができます。あるいは、日-4はEBは、単一細胞に解離し、そのように播種し、人間の神経細胞の低密度の単層で生じた。首尾一貫した結果は、これまで独立して2で得られたデrivedのhESCライン、HuES6とNCL3。

前提条件として、成功したEB形成は一緒hESCの生存^13-14を促進することが知られているROCK阻害剤Y-27632で、合成ポリマー、ポリビニルアルコール（PVA）の使用に厳密に依存していた。その結果、96-Vプレートで形成されたEBの均質性は実質的にランダムな分割手法に基づいて大量培養としてEBの形成に比べて強化されました。このシステムは、このように付着した条件の下で高度に制御されたニューロンの形成に続いて懸濁培養における神経外胚葉形成、有意に改善されたプラットフォームを提供します。

プロトコル

1。マトリゲル被覆プレートとメディアの準備

1. マトリゲルは、EBSの差別化の取り付けのための好ましい基質であることが判明し、また、これらの¹⁰からニューロンの効率的な伸長を促進されたマトリゲル被覆プレートの作製。
   1. 氷の上で一晩マトリゲルの雪解け10ミリリットル。
   2. 翌日、氷のように冷たいDMEM/F-12の2ボリュームとゼリー状のマトリゲルを希釈し、-20℃で凍結保存することができる予冷した15 mlコニカルチューブに1mlのアリコートを準備
   3. 神経分化にプレートフォーマットを決めて。例えば、出発点として、私たちは12ウェルフォーマットにおける分化の最初のラウンドを実行することをお勧めします。 4℃でプレクール4 12ウェルプレートすべて予め希釈マトリゲルは解凍し、溶解するまで上下にピペッティングし、続いて予冷DMEM/F-12 9mlを添加することにより凍結マトリゲルの1アリコートを溶かす。
   4. その後、氷（最終マトリゲル希釈：1:75）にDMEM/F-12の15ミリリットルを含む新しい50 mlチューブに内容を転送します。次に、予め冷却し、12ウェルプレートの各ウェルに希釈したマトリゲルの0.5 mlを加える。パラフィルムでプレートを包み、室温で一晩放置する。
   5. 翌日、4℃にプレートを転送コー​​トされたプレートは、使用前に数週間のために保存することができます。
2. メディア

EB形成培地（1 96ウェルプレートでの差別化を行うのに必要な〜15ミリリットル- 図2の表1及びスキームを参照してください ）：
0.4％（PVA）とDMEM/F-12
1X N2
1X B27
0.05％BSA
20 ng / mlでのFGF2
10μMのY-27632
1X PenStrepGln

分化培地（1 96ウェルプレートでの差別化を行うのに必要な〜30ミリリットルは、1マトリゲル被覆した12ウェルプレートにおけるニューロン形成に続いて、 表1を参照してください ）：
DMEM/F-12
1X N2
1X B27
0.05％BSA
0.5μMのPD0325901
15μMのSB431542
0.5μMのDorsomorphin
1X PenStrepGln

2。強制EB形成

1. お好みのフィーダを含まない条件下でhPSCsを栽培しています。我々は、マトリゲル被覆された6ウェルプレート^15日 、MEF馴化培地を使用しています。しかし、このような自家製または市販の定義されたメディアなど、他の培養系でも動作するはずです。分化実験開始時に、hPSCsはサブコンフルエントと活発に成長しなければなりません。
2. 機械的にステレオ顕微鏡下で滅菌したプラスチック製のピペットチップを用いて自発的に分化したコロニーを削除します。
3. 1X、Y-27632を含むAccutaseを用いて単一細胞にPBS、およびダイジェストを使用して残りの未分化コロニーを洗う。 2分間、200×gで遠心分離によってペレット単一細胞、EB形成の少量の培地で再懸濁し、血球計数器を用いて細胞力価を決定します。
4. に対する細胞のアリコートを追加ミリリットル当たり40,000〜80,000細胞間の力価になり、残りのEB形成媒体。
5. マルチチャンネルピペットを使用して、1ウェルあたり4,000〜8,000個で、その結果、96V底プレートにウェル当たり100μlを移す。 1分間400 xgでスイングアウトプレート遠心機でスピン96ウェルプレートはウェルの底部での細胞を収集し、細胞培養インキュベーターに転送する。 図1に示すように、EBは、一晩形成することになる。

3。神経外胚葉誘導

1. 次の日（0日）、分化培地2mlを含む3.5センチメートル細菌皿に小さな音量でステレオ顕微鏡と転送で96VプレートからEBを収集します。優しくEBを洗うには、数秒のために皿を攪拌。
2. 100分化培地のウェルあたりの超低付着U底96ウェルプレートを追加します。実体顕微鏡下では、96U-ウェルに洗浄皿から小さなボリュームで転送EBS（我あたり1 EBLL）。神経外胚葉の形成を可能にするために4日間細胞培養インキュベーターに96Uプレートを置きます。

4。ニューロン形成

1. 4日目に、ステップ3.1のように洗浄皿を準備し、さらに分化培地（ウェル当たり1ミリリットル）で予め温めマトリゲル被覆した12ウェルプレートにDMEM/F-12を交換してください。
2. EBのメッ​​キ
   1. 96UプレートからEBを収集し、マトリゲル被覆した12ウェルプレート（ウェル当たり約8 EBS）のウェルに、これら上記のように、そして慎重にシードそれらを一つずつ洗っ：EBSは均等の平穏な成長を可能にするためにウェル内に分配されるべきである次回日間のニューロン（ 図2の"5日目"画像を参照してください）。
   2. バックインキュベーターに12ウェルプレートの譲渡の前に、EBを緩く室温で約10分間アタッチすることができます。その後、細胞培養インキュベーターに12ウェルプレートを慎重に移す。ニューロンは、笙のように、次の4日以内に放射状にめっきしたEBから外に成長するだろう図2のWN（ "8日目"右の画像）。

5。単層としてニューロン形成

1. 点4）の手順の代わりに、手順の4日目に、分化培地2mlを含む3.5センチメートル細菌皿にEBを集め、次いでPBS含有皿に少量のEBを転送して、にAccutaseを含む別の皿。
2. 分化培地の小さなボリュームに再懸濁し、単一細胞、2分間、200×gで遠心分離に消化し、血球計数器を用いて細胞力価を決定しましょう​​。分化培地を用いml当たり1-2X10 ⁶細胞（Y-27632は除く）に力価を調整します。
3. 予め温めておいたマトリゲル被覆した12ウェルプレート（ウェル当たり1ミリリットル）、および細胞培養インキュベーターへの転送では、プレートの細胞外。単層としてニューロンの形成は日7から8（ 図3C）間で観察された。それは、しかし、注意すべきは、この単層バリアント手順は完全に細胞の生存および最も適した基板に関して最適化されていません。

結果

我々の以前の報告書では、多くの他の人と並んで、hPSCsからEBを単に低接着皿¹⁰へhPSCsのルーチンを分割する際に凝集体を再播種することによって生成することができます。その結果、EBのサイズ（ 図1C、上側）の広範な分布で、これは通常の結果。このことから生じたもう一つの問題は、懸濁液中に維持されたEBは、EBのサイズのさらに高い異質性につながる、互いに凝集する傾向があるということです。これらの問題を回避するために、我々は、したがって、multititreプレート（ 図1A）の低付着ウェルに単一hPSCsをメッキしてEBを生成しようとしました。これはノーEB形成と細胞死（ 図1B、右下）となりました。 hPSCs、Y-27632、生存のための既知の分子を適用すると、同様の結果が得られた。同様に、以前にhESCを¹⁶のEB形成を増強することが示されている適用ポリビニルアルコール（PVA）は、96Vの下部hPSCsを"収集"する傾向があったウェルが、EB形成には至らなかった。しかし、PVAの補充...

ディスカッション

私たちの以前に公表されている手順^10を含むhPSCs、、からのEB形成を伴う最も分化プロトコルは、手動または必然的にEBのサイズで異質につながる集約などhESCの酵素アシスト収穫に基づいています。この事実は、それによって培地スループットスケールで特に困難な体系的な分析を、レンダリング、いくつかの細胞株を分化効率の変動につながる。さらに、マニュアル解剖自体はスケーラビリティが損なわれる労働集約的である。

これとは対照的に、ここで説明する方法は、細胞のハンドリングとサンプル間のばらつきを最小限に抑えるを容易に単一細胞からEB形成に基づいています。重要なことは、我々は、ニューロンへの全体的な分化能がスピンEBSとプロトコルを開始することによって影響を受けると思われないことを示している。さらに、維持96ウェルサスペンションプレートを用いることによって互いから分離された個々のEBはトンを防止従来の手順¹⁰の更に別の欠点がある-懸濁液中でお互いに集約するから裾。結果として、与えられた実験を開始するために必要な入力hPSCs量は約サブコンhPSCコロニ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
マトリゲルHC	ベクトン·ディッキンソン	354263	取り扱いに関する詳細については本文を参照
DMEM/F-12	ライフテクノロジーズ	21331-020
ポリ（ビニルアルコール）	シグマ	363170	超音波ウォーターバスを使用してDMEM/F-12で0.4％で溶解/過熱を避ける/ 4℃で数週間保存することができる
N2サプリメント	ライフテクノロジーズ	17502-048	100X、凍結アリコートとして保存
B27サプリメント	ライフテクノロジーズ	12587-010	50X、凍結アリコートとして店舗
ウシ血清アルブミン	シグマ	A1595	凍結アリコートとして10％= 500X、店舗
ペニシリン/ストレプトマイシンを含むL-グルタミン	PAA	P11-013	または同等の
FGF2は	Peprotech社	100-18B	凍結アリコートとして0.1％BSA / PBS = 1000X、ストア内の10μg/ mlで溶解
ROCK阻害剤Y-27632	abcamBiochemicals	ASC-129	凍結アリコートとしてDMSO = 1000X、店中の10mMで溶解
PBS	PAA	H15-002	または同等の
Accutase	PAA	L11-007
96ウェルV底プレート	ヌンク	277143
PD0325901	軸索Medchem	アクソン1408	凍結アリコートとしてDMSO = 1000X、店舗が0.5mmで溶解
SB431542	abcamBiochemicals	ASC-163	凍結アリコートとしてDMSO = 1000X、ストア内の15mMで溶解
Dorsomorphin	サンタクルス	SC-200689	凍結アリコートとしてDMSO = 1000X、店舗が0.5mmで溶解
96ウェルU底超低アタッチメントプレート	コー​​ニング	7007
β-IIIチューブリン抗体（マウス）	シグマ	T8660	1:1000で使用
β-IIIチューブリン抗体（ウサギ）	Covance	PRB-435P	1:2000で使用
BRN3A（POU4F1）抗体	サンタクルス	SC-8429	1:500で使用
			表1 </ strong>の具体的な試薬や機器。