本稿では、生きたゼブラフィッシュ胚において光変換性蛍光タンパク質（PCFPs）を光活性化スイッチさせ、さらに発生の特定の時点において光変換されたタンパク質を追跡する方法を提示します。この手法により、生きた脊椎動物個体におけるさまざまな発生過程の根底にある細胞生物学的イベントのモニタリングが可能になります。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
胚発生はダイナミックなプロセスであり、in vivoで発生上の変化を記録できる手法を用いて研究するのが最適です。遺伝子組み換え蛍光タンパク質の利用は、完全な個体内で起こるダイナミックな形態形成プロセスの解明において価値ある戦略であることが証明されています。ここ10年で、光活性化および光変換可能な蛍光タンパク質が開発されたことにより、タグ付けされたタンパク質の特定のサブポピュレーションの運命を追跡することが可能になりました1。光活性化タンパク質とは異なり、光変換可能蛍光タンパク質（PCFP）は、光変換前の天然の放出状態で容易に追跡およびイメージングできるため、光学的な検査によって領域を特定し選択することが容易になります。Kaede2、KikGR3、Dendra4、EosFP5などのPCFPは、UV光または青色光への曝露によって緑色から赤色に変換されます。これは、緑色の発色団を形成するHis-Tyr-Glyトリペプチド配列を持ち、それが光触媒によるβ除去とそれに続くπ共役系の拡張によって赤色の発色団へと光変換されるためです3。PCFPおよびその単量体変異体は、それぞれ細胞追跡6-10およびタンパク質ダイナミクスの研究11-14に有用なツールとなります。近年、細胞運命追跡のために、ゼブラフィッシュ6、ニワトリ7,8、マウス9,10などの異なる動物モデルでPCFPが発現させられています。本稿では、生きたゼブラフィッシュ胚におけるPCFPの細胞特異的な光変換と、その後の発生段階における光変換タンパク質の追跡のためのプロトコルを報告します。この手法により、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいて、形態形成の根底にある細胞生物学的イベントを組織特異的に研究することが可能になります。
プロトコル
1. 光変換アッセイ用胚の採取
PCFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを自家交配させ、最も輝度の高いホモ接合体胚を選択し、目的の胚発生段階に達するまで28.5 °Cで育成します15。
注記1：この事前選択を行うことで、低レーザー出力での胚スキャンが可能となり、光毒性および光退色を防ぐことができます。
注記2：KaedeやKikGRなどのPCFPsは、日光を含む光曝露に対して非常に敏感であるため、胚を可視化する際は低強度の光を使用し、暗所状態で保持することを推奨します。
2. 包埋
- 卵水を入れたガラス容器内で、実体顕微鏡下にてピンセットを用いて胚の卵膜を除去する。
- 卵膜を除去した胚を0.16 mg/mlのトリカイン（3-アミノ安息香酸エチルエステル、Sigma-Aldrich）溶液（1 mlの1X E3培地に4 mg/mlストック溶液を40 μl添加したもの）に移し、胚を麻酔させる。
注記1：胚を損傷させるリスクを最小限に抑えるため、ガラスピペットまたはチップの先端を切断したP1000を用いて胚を移送してください。
注2：脱膜したばかりの若い胚は、機械的ストレスによって卵が破裂しやすいため、空気にさらしたり、水面まで持ち上げたりしないでください。
- 麻酔した胚を培養皿の蓋に移し、可能な限り最小限の量の培地中で保持します。
- 0.16 mg/mlのTricaineを含む30 °Cの1%低融点アガロース（LMA, Lonza）を用いて胚をピペッティングし、カバーガラス底培養皿（MatTek Corp. Ashland MA USA）のカバーガラス上に配置します。その後、滑らかなプラスチックチップ（例：切断したMicroloader Pipette Tip, Eppendorf）を用いて胚の向きを調整し、LMAが重合したら、0.16 mg/mlのTricaine溶液でアガロースを覆います。
注記 1：1% LMAを60 °Cで融解し、融解したアガロースを30 °Cに保持する。
3. 光変換
- Zeiss LSM 710などの405 nm、488 nm、および561 nmのレーザー光源を備えた倒立共焦点顕微鏡を用いて、後で488 nmレーザーで光変換および追跡を行う試料の全構造をカバーするようにz-Stackスキャンを行い、サンプルを可視化します（すなわち, 30 mW Arレーザー（強度5-7%、検出器は493-540 nmに設定）および561 nmレーザー（すなわち、10 mW DPSS 561レーザーを7～9%の強度で用い、検出器を587～651に設定し、光変換可能タンパク質の緑色および赤色の蛍光について、それぞれ組織または器官をスキャンした。
注1：光変換前のスキャンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8 対物レンズを使用しました。
注記 2：不注意により生成された赤色変換PCFPが存在しないことを確認するため、実験前に必ず赤色蛍光のスキャンを行ってください。
- Time seriesツールを選択し、間隔なしで2サイクルに設定します（光変換前と後でそれぞれ1回ずつ）。
- Regionsツールを選択し、光変換を行う1つ以上の関心領域（ROI）を定義します。
注記1：まず、細胞やタンパク質の移動が想定されない固定試料を用い、3方向（xyおよびz方向）すべてで光変換された組織/細胞の領域を測定することで、ROI内で走査レーザーによって実際に光変換された領域が、ソフトウェアで選択したROIとどの程度の精度で一致するかを確認することを推奨します。本アプリケーションで説明した設定では、ROIは光変換領域と非常に高い精度で一致しましたが、これは使用する対物レンズおよび光変換に照射したレーザー量によって異なります。ROIのサイズは、対物レンズの開口数、ズーム倍率、および光変換に使用したレーザー量に応じて、単一細胞のサイズまで縮小することが可能です。
- Bleachingツールを選択し、2回中の1回目のスキャンの後にブリーチングを開始するように設定します。光変換には30 mW 405 nmのダイオードレーザーを使用し、完全な光変換に必要な最小限のレーザー光量となるよう慎重に最適化しました。これは主に、レーザー光の強度、ROIのスキャン反復回数、およびピクセル時間（すなわち、スキャン速度）を調整することで達成されます。
注1：フォトコンバージョンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8 対物レンズを使用しました。
注記 2：レーザー出力と反復回数は、各実験条件に合わせて経験的に決定する必要があります。光毒性を軽減するため、必要最小限のレーザー光量で、ROI内の緑色PCFPから赤色への完全な光変換が行われるようにしてください。まず、低いレーザー出力（例：3 %、対物レンズ面で0.03 mWに相当）と少ない反復回数（例：20回）でテストを開始し、その後、完全な光変換が達成されるまでレーザー出力を上げていくことを推奨します。我々の検討では、レーザー出力10 %（対物レンズ面で0.1 mWに相当）で完全な光変換が達成されました。これらの条件下では、テストしたすべての胚が処理プラン後も生存しました。しかしながら、卵黄膜はレーザーパルスに敏感であり、容易に損傷して胚を死なせる可能性があることが観察されました。そのため、標的組織の位置が卵黄体に近すぎる場合、光変換後に胚が致死となる可能性があります。
- 488 nmおよび561 nmのレーザーを用いて、z-Stackスキャンを行い、残留している緑色蛍光および光変換されたPCFPの赤色蛍光を可視化します。
注1：光変換後のスキャンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8を使用しました。
4. アガロースから胚を取り出す
- 溶液を廃棄し、針または滑らかなプラスチックチップを用いて、1% LMAから胚を注意深く取り出す。
- 目的の発達段階に達するまで、胚を卵水中で28.5 °Cの暗所に保持する。
注1：胚が卵水の中で発達を続けること、特に胚体が伸長する発達初期の数日間において重要です。実際、一部の胚組織や器官は発達に伴い位置が変化するため、埋没時に特定の方向を向かせる必要があります。これは、目的とする組織・器官や、解析したい発達段階によって異なります。
5. 再包埋
- 本プロトコルの2.)の手順に従って進めてください。
6. 後期胚段階における光変換組織の追跡
- 488 nmおよび561 nmのレーザーを用いて、それぞれ緑色および赤色の蛍光信号の関心領域をスキャン（z-Stack）します。
注1：光変換からx時間後のスキャンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8を使用しました。
注記2：本プロトコルは胚の正常な発生に影響を与えないため、発生後のより後期のステージにおいて光変換された胚を観察することが可能です（その場合は、手順4〜6に従って操作を行ってください）。
7. 代表的な結果
光変換アッセイの例をFigure 1に示す。我々はゼブラフィッシュの発育過程における血管内皮細胞を追跡した（発育中のゼブラフィッシュの血管解剖学のレビューについては16を参照）。そのため、血管内皮の核内にKikGRを発現するゼブラフィッシュTg(kdrl:nlsKikGR)hsc7レポーター系統を用いた17。ホモ接合体で強く発現している胚を、受精後48時間（hpf）まで28.5 °Cで育成した。卵膜除去後、胚を麻酔し、頭部血管をより良好に可視化するために、胚の前背側をカバーガラスに向けてLMAに埋め込んだ。光変換アッセイおよび光変換後のタンパク質の追跡には、405 nm、488 nm、561 nmで動作するレーザーとPlan Apochromat 20x/NA 0.8対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 710 Meta）を使用した。Figure 1Aに示すように、光変換前、KikGRは血管内皮組織内で発現しており、488 nmアルゴンレーザーを用いた緑色蛍光としてのみ検出された。赤色蛍光を確認するための561 nm DPSS 561-10レーザーによるコントロールスキャンでは、光変換前に光変換されたKikGRは検出されなかった（Figure 1A）。続いて、405 nmダイオードレーザー（強度10%、20回反復）を用いてROIを完全に光変換し、488 nmおよび561 nmレーザーを用いて頭部血管を再度スキャンした（Figure 1B）。Figure 1Bに示すように、ROI内では緑色のKikGRが完全に赤色に切り替わっていた。光変換アッセイの後、胚をアガロースから取り出し、卵水中で28.5 °Cで育成した。最後に、光変換後の血管内皮細胞の後期段階での挙動を追跡するため、光変換から24時間後（約72 hpf）に胚を再度観察した（Figure 1C）。そこで、胚をLMAに埋め込み、488 nmおよび561 nmレーザーを用いてサンプルを再スキャンした。Figure 1Cに示すように、光変換したROIから生じた血管内皮組織内では、赤色蛍光を持つ光変換KikGRの安定性と、新たに合成された緑色の非光変換KikGRの両方が観察された。
図 1. ゼブラフィッシュの発生過程におけるKikGRの光変換。(A,B) Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 転換胚の 48 hpf において、頭部血管内皮の特定領域を光変換し、(C) 光変換から 24 時間後（約 72 hpf）に再度観察した。KikGR（緑）、光変換後のKikGR（赤）、およびマージ画像をそれぞれ示す。点線で囲まれた円は、光変換前、光変換直後、および光変換 24 時間後のROIを示す。画像はゼブラフィッシュ胚の背面図であり、下方向が前方である。スケールバー：50 μm。
| タンパク質（略称） | 励起波長 (nm) | 蛍光波長 (nm) | 消光係数 (EC) | 量子収率 (QY) | 四次構造 | 輝度 | 用途 | 参考文献 |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | 四量体 | 259 | 細胞トラッキング | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | 四量体 | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | 四量体 | 112 | 細胞トラッキング | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | 四量体 | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | 単量体 | 101 | ダイナミックトラッキング、超解像像 | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | 単量体 | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | 四量体 | 150 | 細胞トラッキング | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | 四量体 | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | タンデム二量体 | 165 | 超解像像 | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | タンデム二量体 | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | 単量体 | 140 | ダイナミックトラッキング、超解像像 | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | 単量体 | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | 単量体 | 67 | ダイナミックトラッキング、超解像像 | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | 単量体 | 57 |
表I. 光変換性蛍光タンパク質の特性. 各PCFPの一般名および/または略称とともに、最大励起（Ex）および蛍光（Em）波長、モル吸光係数（EC, 10-3 M-1 cm-1）、量子収率（QY）、生理的に関連のある四次構造、相対輝度（EGFPに対する%として）、用途、および参考文献を表に示す。表はDay and Davidson, 20101より改変。
| PCFP | ゼブラフィッシュ形質転換系統 | ソース |
| 楓 | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | 岡本研究室 |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | 東島研究室 | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
表 II. PCFPを発現するゼブラフィッシュ転写遺伝子系統。ゼブラフィッシュモデル生物データベース（ZFIN, http://zfin.org/）から得られたデータ。ゼブラフィッシュ国際リソースセンター（ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/）における系統の利用可能性について示している。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
近年、KaedeやKikGRなどの光変換タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルが作製されています。これらの動物は正常に成長することから、これらのタンパク質が胚発生に毒性影響を及ぼさないことが示されています。動物胚における細胞追跡のための光変換アッセイに関する最初の報告はHattaらによって行われ、KaedeをコードするmRNAまたはDNAをゼブラフィッシュの1細胞期胚に注入して普遍的に発現させた例や、Gal4-UASシステムを用いて神経組織でKaedeおよびKikGRを発現させた例が示されました6。彼らは細胞の移動や神経形態の追跡を可視化することができ、これにより、神経管形成、プラコード形成、後脳における初期交連軸索のナビゲーションといった形態形成プロセスの追跡における本ツールの汎用性が実証されました6。ニワトリモデルでは、エレクトロポレーションによりKikGRを神経管に導入し、神経堤または神経管内で光変換させることで、ニワトリ胚の遊走流の中にある神経堤細胞のサブグループを選択的に標識することに使用されました8。また、マウスにおいてもKaedeとKikGRの光変...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反はありません。
謝辞
カナダ、トロントのHospital for Sick ChildrenのIan C. Scott博士に、ゼブラフィッシュ形質転換体Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7系統をご提供いただいたことに感謝いたします。また、優れた技術的支援および画像解析全般をサポートしていただいたConfocal and 2-Photon Microscopy Core Facility（Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine）およびZoltan Cseresnyes博士に感謝いたします。S.A.-S.は、ドイツ研究振興協会（DFG）のハイゼンベルク・フェローシップの支援を受けています。本研究は、DFG助成金SE2016/7-1の支援を受けました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 材料: | |||
| 魚の飼育および卵の採取に必要な設備（詳細はZebrafish Book22を参照）。 | |||
| 実体顕微鏡 | Leica | Lecia MZ6 Stereomicroscope | 488 nmで動作するレーザー搭載 |
| 共焦点レーザー走査顕微鏡 | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | 488 nm、561 nm、および405 nmで動作するレーザー搭載 |
| ヒーティングブロック | |||
| Dumont #5 ピンセット | |||
| カバーガラス底培養皿 | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| マイクロローダーピペットチップ | Eppendorf | ||
| ボルテックスミキサー | |||
| 針 | |||
| 試薬: | |||
| 卵用水培地 | |||
| 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O | |||
| E3培地 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4 | |||
| 0.00001% (w/v) メチレンブルー | |||
| 4 mg/ml トリカインストック溶液 | |||
| 400 mg トリカイン (3-amino benzoic acid ethylester) | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH9) | |||
| pH 7に調整し、分注して-20 °Cで保存する | |||
| 1% LMA (低融点アガロース, Lonza) | |||
| 1g LMA / 100 ml E3 medium 1X | |||
| 分注し、4 °Cで保存する |
参考文献
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
- Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
- Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
- Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
- Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
- Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
- Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
- Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
- Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
