ここでは、生きたゼブラフィッシュの胚における光変換性蛍光タンパク質(PCFP)の光活性化スイッチの方法と、発生中の特定の時点での光変換タンパク質のさらなる追跡方法を紹介します。この方法論により、生きた脊椎動物におけるさまざまな発生過程の根底にある細胞生物学的事象をモニタリングすることができます。
方法論記事
ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング
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この記事について
サマリー
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要約
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胚発生は、生体内での発生変化の記録を可能にする技術を使用して最もよく研究される動的プロセスです。遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の使用は、無傷の生物で発生する動的な形態形成プロセスを解明するための貴重な戦略であることが証明されています。過去10年間で、光活性化可能な蛍光タンパク質と光変換可能な蛍光タンパク質の開発により、タグ付きタンパク質の個別の亜集団の運命を調査する可能性が開かれました1。光活性化可能なタンパク質とは異なり、光変換可能な蛍光タンパク質(PCFP)は、光変換前に天然の発光状態で容易に追跡およびイメージングできるため、光学検査による領域の同定と選択が容易になります。Kaede2、KikGR3、Dendra4、EosFP5などのPCFPは、His-Tyr-Glyトリペプチド配列により、光触媒によるβ除去とそれに続くπ標識系3の伸長により赤色の発色団に光変換できるHis-Tyr-Glyトリペプチド配列により、紫外線または青色光にさらされると緑色から赤色にシフトすることができます。PCFPとその単量体変異体は、それぞれ細胞6-10の追跡およびタンパク質動態11-14の研究に有用なツールです。近年、PCFPは、ゼブラフィッシュ6、ニワトリ7,8、マウス9,10などのさまざまな動物モデルで発現し、細胞運命の追跡を行っています。ここでは、生きたゼブラフィッシュ胚におけるPCFPの細胞特異的光変換と、後の発達段階での光変換タンパク質のさらなる追跡のためのプロトコルを報告します。この方法論により、ゼブラフィッシュ動物モデルにおける形態形成の根底にある細胞生物学的事象を組織特異的に研究することができます。
プロトコル
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1. 光変換アッセイのための胚の取得
PCFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを交配すると、最も明るいホモ接合体の胚が選ばれ、目的の胚期15まで28.5°Cで増殖します。
注1:この事前選択により、低レーザー出力で胚をスキャンすることができ、光毒性と光退色を防ぐことができます。
注2:胚を可視化する際には低強度の光を使用し、KaedeやKikGRなどのPCFPは昼光を含む光の曝露に対する感度が高いため、胚を暗所で維持することをお勧めします。
2. 埋め込み
- 卵水を入れたガラス容器に、鉗子を使用して実体顕微鏡下で胚を脱毛します。
- デコレーション胚を0.16 mg/mL Tricaine(3-アミノ安息香酸エチルエステル、Sigma-Aldrich)溶液(E3培地1X1 mL中40 mg/mLストック溶液40μl)に移し、胚を麻酔します。
注1:ガラスピペットまたはカットチップ(P1000)で胚を移植し、胚を損傷するリスクを最小限に抑えます。
注2:若い脱毛胚は、機械的ストレスを受けると卵子が簡単に破裂するため、空気にさらしたり、水と空気の界面に持ち上げたりしないでください。
- 麻酔をかけた胚を培養皿の蓋に移し、胚を可能な限り最小の培地に維持します。
- 0.16 mg/mLのトリカインを含む30°Cで1%低融点のアガロース(LMA、Lonza)で胚をピペッティングして胚をアガロースに移し、カバーガラス底の培養皿(MatTek Corp.、Ashland、MA、USA)のカバーガラス上に置きます。その後、滑らかなプラスチック製のチップ(カットされたマイクロローダーピペットチップ、エッペンドルフなど)を使用して胚の向きを定め、LMAが重合したら、アガロースを0.16 mg / mlトリカイン溶液で覆います。
注1:1%LMAを60°Cで溶融し、溶融したアガロースを30°Cで維持します。
3. 光変換
- Zeiss LSM 710のような405 nm、488nmおよび561nmレーザー源を装備した倒立共焦点顕微鏡で、488 nmレーザー(すなわち、30 mW Arレーザー、5-7 %強度、検出器は493-540 nmに設定)および561 nmレーザー(すなわち、、10 mW DPSS 561レーザー、7-9 %強度、検出器587-651)で、光変換性タンパク質の緑色と赤色の蛍光について組織/器官をそれぞれスキャンします。
注1:光変換前のスキャンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8対物レンズを使用しました。
注2:実験前に常に赤色蛍光をスキャンして、誤って生成された赤色に変換されたPCFPが存在することを除外してください。
- 時系列ツールを選択し、インターバルなしで2サイクルに設定します(1つは写真変換前用、もう1つは写真変換後用)。
- [領域] ツールを選択し、光変換の 1 つ以上の関心領域 (ROI) を定義します。
注1:まず、細胞やタンパク質の移動が予想されない固定試料において、光変換された組織/細胞の3つ(xy方向とz方向)の面積を測定し、ROI内の走査型レーザーで実際に光変換された領域がソフトウェアで選択されたROIと一致する精度を決定することをお勧めします。このアプリケーションで説明されている設定では、ROIは光変換された領域と非常に正確に一致しましたが、これは使用される対物レンズと光変換に適用されるレーザーの量によって異なります。ROIのサイズは、対物レンズの開口数、ズーム係数、および光変換に使用されるレーザー光の量に応じて、単一のセルのサイズに縮小できます。
- 漂白ツールを選択し、スキャン1/2の後に漂白を開始するように設定します。光変換には30mWの405nmダイオードレーザーを使用し、レーザー光の強度、ROIのスキャン反復、およびピクセル時間(スキャン速度)を変化させることによって主に達成される完全な光変換に必要な最小限のレーザー光量に慎重に最適化しました。
注1:光変換には、Plan Apochromat 20x/NA 0.8対物レンズを使用しました。
注2:レーザーの出力と反復回数は、実験設定ごとに経験的に決定する必要があり、光毒性を減らすために必要なレーザー光の量を最小限に抑えて、ROI内で緑から赤のPCFPへの完全な光変換を確保する必要があります。低レーザー出力(例:3%、目標平面図の0.03 mWに相当)と低反復回数(例:20)を組み合わせてテストを開始し、その後、完全な光変換が達成されるまでレーザー出力を増やすことをお勧めします。これは、私たちの手元では10%のレーザー出力(目標平面の0.1 mWに対応)でした。これらの条件下で、試験されたすべての胚は治療計画を生き延びました。それにもかかわらず、卵黄膜はレーザーパルスに敏感であり、容易に損傷して胚を死に至らしめる可能性があることを観察しました。このため、標的組織の位置が卵黄体に近い場合、光変換後の胚致死が引き起こされる可能性があります。
- 488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してz-Stackでサンプルをスキャンし、PCFPの残りの緑色と光変換された赤色の蛍光を視覚化します。
注1:光変換後のスキャンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8を使用しました。
4. アガロースから胚を取り除く
- 溶液を廃棄し、針または滑らかなプラスチックチップを使用して1%LMAから胚を慎重に取り出します。
- 胚を暗所28.5°Cの卵水に置き、所望の発達段階まで維持します。
注1:胚が卵水中で発生を続けることは、特に胚体の拡大中の発生の最初の数日間に重要です。実際、一部の胚組織/器官は発生中に位置が変化するため、埋込中に特定の向きが必要になりますが、これは目的の特定の組織/器官と分析の望ましい発生段階によって異なります。
5. 再埋め込み
- このプロトコルのポイント2.)のように進めてください。
6. 後期胚期の光変換された組織の追跡
- 488 nmおよび561 nmのレーザーを使用して、それぞれ緑色および赤色の蛍光シグナルで関心領域(z-Stack)をスキャン。
注1:光変換後x時間のスキャンには、Plan Apochromat 20x/NA 0.8を使用しました。
注2:このプロトコルは胚の正常な発生に影響を与えないため、発生の後の段階で光変換された胚を観察することができます(これについては、ポイント4〜6で概説したように進めてください)。
7. 代表的な結果
図1に光変換アッセイの一例を示します。ゼブラフィッシュの発生中に内皮細胞を追跡しました(発生中のゼブラフィッシュの血管解剖学的構造のレビューについては、16を参照)。そこで、ゼブラフィッシュTg(kdrl:nlsKikGR)hsc7レポーターラインを用いて、内皮核17内でKikGRを発現させた。ホモ接合体で明るく発現する胚を、受精後48時間(hpf)まで28.5°Cで育てました。デコレーション後、胚に麻酔をかけ、LMAに埋め込んで、胚の前面と背側をカバーガラスに向けて配置し、頭部血管の視覚化を改善しました。405 nm、488 nm、561 nmで動作するレーザーを搭載した倒立共焦点顕微鏡(Zeiss LSM 710 Meta)と、Plan Apochromat 20x/NA 0.8対物レンズを使用して、光変換アッセイと光変換タンパク質のさらなる追跡を行います。図1Aに示すように、光変換前は、KikGRは内皮組織内で発現しており、488 nmのアルゴンレーザーを使用して緑色蛍光としてのみ検出可能でした。561 nm DPSS 561-10レーザーによる赤色蛍光のコントロールスキャンでは、光変換前に光変換されたKikGRは検出されませんでした(図1A)。その後、ROIを405 nmのダイオードレーザー(10 %の強度、20回の反復)を使用して完全に光変換し、488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してヘッド血管を再度スキャンしました(図1B)。図1Bに示すように、ROI内で緑のKikGRは完全に赤に切り替わっていました。光変換アッセイ後、胚をアガロースから取り出し、卵水中で28.5°Cで育てました。最後に、光変換後24時間、約72 hpfで胚を再度観察し、後の段階で光変換された内皮細胞を追跡しました(図1C)。したがって、胚をLMAに埋め込み、サンプルを488nmおよび561nmレーザーを使用して再スキャンしました。図1Cに示すように、光変換されたROIから生じる内皮組織内では、赤色蛍光光変換KikGRの安定性と新しい緑色非光変換KikGRの再合成により、非光変換KikGRタンパク質と光変換されていないKikGRタンパク質の両方が観察されました。
図 1.ゼブラフィッシュ現像時のKikGRの光変換(A,B) Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7トランスジェニック胚において、内皮頭部血管系の特定の領域が48 hpfで光変換され、(C)光変換の24時間後(約72 hpf)に再度観察された。KikGR(緑)、光変換されたKikGR(赤)、およびマージされたチャネルの蛍光が示されています。点線の円は、光変換前、変換後、および24時間後のROIを示しています。画像は、ゼブラフィッシュの胚の背側図で、底の前方にあります。スケールバー:50μm。
| タンパク質(頭字語) | Ex (nm) | EM (nm) | EC事業 | QYの | 四次構造 | 明るさ | アプリケーション | 参照 |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | テトラマー | 259 | セルトラッキング | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | テトラマー | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | テトラマー | 112 | セルトラッキング | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | テトラマー | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | モノマー | 101 | 動的追跡超解像画像 | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | モノマー | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | テトラマー | 150 | セルトラッキング | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | テトラマー | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | タンデムダイマー | 165 | 超解像画像 | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | タンデムダイマー | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | モノマー | 140 | 動的追跡超解像画像 | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | モノマー | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | モノマー | 67 | 動的追跡超解像画像 | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | モノマー | 57 |
表I.光変換可能な蛍光タンパク質の特性。 各PCFPの一般名および/または頭字語とともに、ピーク励起(Ex)および発光(Em)波長、モル吸光係数(EC、10-3 M-1 cm-1)、量子収率(QY)、生理学的に関連する四次構造、相対輝度(EGFPの%として)、アプリケーション、および参考文献が表に示されています。表はデイとデビッドソン、20101から適応。
の の| PCFP | ゼブラフィッシュのトランスジェニック系統 | 源 |
| 楓 | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | 岡本研究室 |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:楓) | ||
| Tg(ins:楓) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:楓) | ||
| Tg(lhx5:楓)b1204/+ | ジルク | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:楓) | ||
| Tg(UAS-E1b:楓)s1999t | ジルク | |
| Tg(UAS:楓)rk8 | ジルク | |
| Tg(vsx2:楓)nns2 | 東島研究室 | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGRの) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| デンドラ | Tg(-8mpx:デンドラ2) | |
| Tg(UAS:デンドラクラス) |
表II.ゼブラフィッシュのPCFPを発現するトランスジェニック系統ゼブラフィッシュモデル生物データベース(ZFIN, http://zfin.org/)で得られたデータ。ゼブラフィッシュ国際リソースセンター(ZIRC、http://zebrafish.org/zirc/)のラインの可用性が示されています。
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ディスカッション
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近年、KaedeやKikGRなどの光変換性タンパク質の発現のためのトランスジェニック動物モデルが作製されています。これらの動物は正常に発育し、これらのタンパク質が胚の発生に毒性作用を及ぼさないことを示しています。動物胚の細胞を追跡するための光変換アッセイに関する最初の報告は、八田らの共同研究者によって、楓をコードするmRNAまたはDNAを1細胞ゼブラフィッシュ胚に注入してユビキタスに発現させるか、Gal4-UASシステムを使用して神経組織に楓とKikGRを発現させることによって実施されました6。彼らは細胞の動きと神経形状のトレースを視覚化することができ、後脳の神経形成、プラコード形成、初期交連軸索のナビゲーションなどの形態形成プロセスを追跡するためのこのツールの汎用性を実証しました6。ニワトリモデルでは、KikGRはエレクトロポレーションによって神経管に導入され、神経堤または神経管で光変換され、ニワトリ胚8の移動ストリーム内の神経堤細胞のサブグループを選択的にマークするために使用されました。KaedeとKikGRの光変換もマウスで比較され、KikGRは発生的に中立で明るく...
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開示事項
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利益相反は宣言されていません。
謝辞
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カナダのトロントにあるHospital for Sick ChildrenでゼブラフィッシュのトランスジェニックTg(kdrl:nlsKikGR)hsc7ラインを提供してくださったイアン・C・スコット博士に感謝します。共焦点および2光子顕微鏡コアファシリティ(Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine)とDr. Zoltan Cseresnyesは、優れた技術支援と全体的なイメージングサポートを提供します。S.A.-S.は、ドイツ研究振興協会(DFG)のハイゼンベルクフェローシップの支援を受けています。本研究はDFG grant SE2016/7-1の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 材料: | |||
| 魚の飼育や卵採集に必要な装備(詳細はゼブラフィッシュBook22を参照)。 | |||
| 実体顕微鏡 | ライカ | レシアMZ6 実体顕微鏡 | 488nmで動作するレーザーを装備 |
| 共焦点レーザー走査顕微鏡 | ツァイ | スツァイス LSM 710 NLO | 488nm、561nm、405nmで動作するレーザーを装備 |
| 加熱ブロック | |||
| デュモンのペア #5 鉗子 | |||
| カバーガラス底培養皿 | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| Microloader Pipette Tips | Eppendorf | ||
| Vortex | |||
| needles | |||
| Reagents: | |||
| 卵水 medium | |||
| >60 μddH2O | |||
| E3 medium | |||
| >5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4> | |||
| 0.00001% (w/v) メチレンブルー | |||
| 4 mg/ml トリカイン原液 | |||
| >400 mg トリカイン (3-アミノ安息香酸エチルエステル) | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH9) | |||
| pH 7で調整し、-20 °C | |||
| 1% LMA (低融解温度アガロース、ロンザ) | |||
| >1g LMA/100 ml E3 medium 1X | |||
| Aliquot and store at 4 °ハ | |||
参考文献
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